苍术-白术药对治疗小儿厌食症的机制研究*

吕彩兰，杨楠，陈静，李玉霞

甘肃中医药大学附属医院 甘肃兰州 730020

小儿厌食症[1]（Infantile anorexia，IA）是好发于儿童各个年龄阶段的一种慢性食欲障碍性疾病，1～6岁儿童多见。研究报道[2]12%～34%儿童具有不同程度的厌食状态。IA的机制复杂多样，目前相关研究[3]发现其发生机制与消化酶活性、食欲调节中枢、摄食调节关键区域功能、食欲调节因子分泌异常具有相关性。西医主要[4]以补充微量元素、调节肠道菌群、心理疏导及促进肠道治疗为主。中医认为小儿脾常不足，IA多是由喂养不当致脾胃功能失职失调所致，其根本病机为脾运失健、胃纳失常。全国名中医张士卿教授认为，IA病位在中焦，脾胃虚弱之时兼有食积、中焦气滞、湿困热郁等。苍术归脾胃、肝经，具有燥湿健脾之功，尤适宜湿阻中焦之证；白术归脾胃经，有益气健脾、燥湿利水之效，尤适脾虚湿滞之证。《玉楸药解》曰：“白术守而不走，苍术走而不守，故白术善补，苍术善行”。故，张教授[5]常用苍术-白术相配一散一补、一胃一脾，使中焦健运、脾胃受纳，从而使水谷精微代谢正常，以消疾患。因此，为进一步探讨苍术-白术药对防治IA的药效物质基础，本研究基于网络药理学方法探讨其潜在作用机制。

材料与方法

1 数据库及软件

中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；通用蛋白质（UniProt）数据库（https：//www.uniprot.org/）；人类基因（GeneCards）数 据 库（http：//www.genecards.org/）；R 语 言 软 件（https：//www.r-project.org/）；Perl软 件（https：//www.perl.org/）；蛋白质互作平台 （STRING 11.0）（https：//string-db.org/）；网络拓扑属性分析软件（Cytoscape 3.8.0）（https：//cytoscape.org/）；Bioconductor （https：//www.bioconductor.org/）。

2 药物活性成分及作用靶点检索

以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件在TCMSP筛选苍术、白术的化学成分，并在TCMSP数据库预测中药活性成分作用的潜在靶点。在UniProt数据库对预测获得的活性成分作用靶点进行校正。

3 疾病靶点的检索

在GeneCards数据库以“infantile anorexia”为关键词检索获取已被研究证实的小儿厌食症疾病靶点。

4 药物与疾病共同靶点筛选

采用R语言软件筛选药物与疾病共同靶点，并以韦恩图可视化展示。

5 药物成分与疾病靶点互作网络构建

采用Cytoscape 3.8.3软件构建苍术-白术药对活性成分与疾病靶点互作网络。

6 共同靶点蛋白互作网络构建

共同靶点蛋白互作网络（PPI）的建立采用STRING 11.0数据库完成，并利用R语言软件对PPI进行可视化分析。

7 基因本体（Gene Ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

采用R语言软件对共同靶点进行GO与KEGG富集分析。通过GO分析获得共同靶点的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF），并以气泡图形式展示；通过KEGG富集分析获得共同靶点富集的通路，并以气泡图形式展示。

结 果

1 药物活性成分及作用靶点获取

以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件在TCMSP数据库共检索苍术-白术药物活性成分5种见表1；药物活性成分靶点86个，经UniProt矫正后获取药物靶点37个，见表2。

表1 药物活性成分

表2 药物靶点

2 疾病靶点检索及药物与疾病共同靶点筛选

在GeneCards数据库检索疾病靶点共920个，采用R语言软件筛选药物与疾病共同靶点15个，见表3；并绘制韦恩可视化展示，见图1。

图1 疾病与药物共同靶点韦恩可视化

表3 药物与疾病共同靶点

3 构建药物活性成分与共同靶点互作网络

利用Cytoscape 3.8.3构建药物成分与共同靶点互作网络，并依据degree值对靶点的重要性可视化展示，见图2。

图2 药物成分-共同靶点互作网络

4 PPI构建及可视化分析

PPI构建见图3，并用R语言软件对其可视化展示发现degree值较高（≥6）的蛋白包括周期蛋白1（CyclinD1，CCND1）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（ Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、白介素 -6（Interleukin 6，IL-6）、糖原合酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，MAPK1）、骨髓细胞白血病 1（myeloid cell leukemia-1， MCL1）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9（ Cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）等，见图 4。

图3 PPI网络

图4 PPI可视化分析

5 GO分析及KEGG富集分析

通过 GO 分析最终获得共同靶点参与qvalue＜0.05的生物学过程（biological process，BP）包括对类固醇激素的反应（response to steroid hormone）、缺乏配体的信号转导（signal transduction in absence of ligand）、在没有配体的情况下的外在凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）、外在凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signal-ing pathway）、对糖皮质激素的反应（response to glucocorticoid）、对皮质类固醇的反应（response to corticosteroid）、神经元死亡（neuron death）等 834个，参与qvalue＜0.05的细胞组分（cellular component，CC）包括线粒体外膜（mitochondrial outer membrane）、细胞器外膜（organelle outer membrane）、外膜（outer membrane）等3个、参与qvalue＜0.05的分子功能（molecular function， MF）包括核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性，直接由配体调控的序列特异性DNA 结 合（transcription factor activity， direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、p53结合（p53 binding）、死亡域结合（death domain binding）、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、蛋白酶结合（protease binding）、RNA聚合酶II转录因子结合（RNA polymerase II transcription factor binding）、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性（cyclin-dependent protein serine/threonine kinase regulator activity）等77个，以qvalue大小为依据，取前10个BP、CC、MF结果用气泡图形式展示，见图5；通过KEGG 富集分析结果发现共同靶点富集参与的通路包括麻疹（Measles）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、大肠癌（Colorectal cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、小 细 胞 肺 癌（Small cell lung cancer）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、凋亡-多种（Apoptosis- multiple species）等71条通路，以qvalue大小为依据，取前30条通路以气泡图形式展示，见图6。通过GO分析与KEGG富集分析可见苍术-白术有效活性成分与疾病靶点有潜在的结合活性，可进一步推测苍术-白术药对防治小儿多动症的机制。

图5 GO分析

图6 KEGG富集分析

讨 论

《灵枢·脉度》记载“脾气通于口，脾和则口能知五谷矣”，《诸病源候论·脾胃病诸侯》曰：“脾者脏也，胃者腑也，脾胃二气，相为表里，胃为水谷之海，主受盛饮食者也；脾气磨而消之，则能食。今脾胃二气俱虚弱，故不能饮食也”，可见脾气健则食欲强，脾气虚则水谷不化，不知五味。中医学[6]认为，治疗IA重在辨证论治，强调调和脾胃。苍术虽是燥湿健脾，但重在行气；白术则益气健脾，重在补气。二者相配，一行一补，则补而不滞。全国名中医张士卿教授在临床应用苍术-白术药对治疗IA效果显著。

本研究基于网络药理学研究发现，苍术-白术药对治疗IA的主要靶点为CCND1、Caspase-3、IL-6、MAPK1、MCL1、Caspase-9、BCL2 等。Caspase 是一类存在于细胞质内的天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键的作用，活化的caspase-3、Caspase-9蛋白是细胞凋亡标志。研究发现[7-8]新生大鼠肠道损伤后BCL2蛋白表达水平下调，而活化的Caspase-3、Caspase-9表达水平升高；研究发现[9]通过改善血清IL-6水平可调节肠道屏障功能，从而有效改善患儿腹泻、腹痛等，亦有发现表明[10]血清IL-6、TNF-α的表达水平与肠道菌群平衡具有相关性。本研究发现苍术-白术药对干预的潜在信号通路可能是麻疹、p53信号通路、大肠癌、前列腺癌、脂质和动脉粥样硬化、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、小细胞肺癌（Small cell lung cancer）、PI3K-Akt信号通路、EB病毒感染、凋亡-多种等信号通路。研究发现[11-12]PI3K/AKT/e NOs信号通路可能大鼠慢传输型便秘的发病中扮演重要作用，在慢传输型便秘模型大鼠结肠中PI3K、AKT mRNA及蛋白表达水平较高，通过调控PI3K、AKT mRNA及蛋白表达水平可显著改善肠道蠕动功能、改善便秘。因此本研究推测PI3K-AKT信号通路可能在IA中扮演重要作用。研究发现[13]苍术提取物对脾虚证大鼠胃粘膜损害及免疫功能具有改善作用；亦有研究发现[14]复方苍术方可能通过调节肠道菌群结构对肠道微环境具有改善作用。研究发现[15-16]，白术通过调节胃肠道的肠神经系统、胃肠激素及神经递质的机制具有促进胃排空及小肠推进、抑制胃肠道运动等作用；除此之外，白术亦具有调节肠道微生态、修复胃肠道黏膜损伤及抗炎的作用。

综上所述，本研究发现苍术-白术药对可能是通过作用于相关通路与关键靶点蛋白，通过调节肠道菌群、改善肠道动力、修复胃肠道黏膜损及抗炎等机制防治IA。