桂枝甘草汤治疗室性早搏的作用机制探讨*

陈志娟，耿乃志

1 黑龙江中医药大学 黑龙江哈尔滨 150000

2 黑龙江中医药大学附属第一医院 黑龙江哈尔滨 150000

室性期前收缩（premature ventricular beats），又名室性早搏，心律失常中最常见的类型之一，是希氏束及其分支以下的异位兴奋点提前进行除极从而产生的。该病在中医学上归类为"心悸"、"怔忡"，临床上主要有以下几种表现：即自觉心悸、胸闷、心跳间歇、脉结代等[1]。由器质性病变导致的室性早搏，由器质性病变引起导致的室性早搏，西医学上治疗的药物有较为确切的疗效，特别重要的是对于原发病的治疗方面，以及对该类疾病进行综合护理等各个方面，但临床应用中仍然会受到诸多限制，如对于药物存在不良反应和严格手术适应症。因此更为安全有效的治疗方法的研究意义重大。

室性早搏的中医药治疗历史悠久[2]。近年来，经方治疗室性早搏取得良好进展，临床较多采用的如桂甘龙牡汤、炙甘草汤、桂枝甘草汤等在基础研究及临床应用中均取得较大进展[3]。其中桂枝甘草汤起源于《伤寒论》，该药方被认为是温补心阳的药物基础方，且研究表明，中药治疗室性早搏使用频率最高的药对为甘草-桂枝药对，有养血益气、温经通阳、定悸复脉的功效[4]。本文采用中药系统药理学方法挖掘桂枝甘草汤的活性成分及靶点，揭示”药物-成分-疾病靶点”的相互作用，为研究室性早搏的中药作用机制提供思路，为临床上的广泛应用提供理论依据。

材料与方法

1 桂枝甘草汤活性成分的收集

通过中药系统药理学分析平台及数据库（TCMSP）检索桂枝和甘草2味药物的主要药理化学成分，所需成分的筛选条件设定为口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18，得到2味药物的化学成分。

2 桂枝甘草汤活性成分对应靶标的获取

利用TCMSP检索桂枝和甘草的活性成分所对应的靶标，并通过Uniprot数据库获得靶点的标准基因的名称。

3 室性早搏疾病靶标的获取

通过检索GeneCards和OMIM数据库中与室性早搏相关的靶基因并进行去重、合并，得到室性早搏相关靶点。

4 药物-成分-疾病靶标网络的构建与分析

取桂枝甘草汤的活性成分对应的靶点与室性早搏疾病的靶点的交集，从而获得药物治疗该疾病靶点，并绘制Venn图。使用Cytoscape3.8.2软件构建疾病-药物-活性成分-关键靶点网络关系图，探究桂枝甘草汤治疗室性早搏的作用机制。

5 PPI网络构建

将桂枝甘草汤治疗室性早搏潜在作用的靶蛋白导入STRING数据库，设定物种为“人”，获得各蛋白之间相互作用的网络，参数保持默认设置，隐藏网络中无联系的节点，将结果以TSV格式导出，并使用R语言将每个靶标的连接数目进行排序，将前30位关键靶标基因用柱状图的形式列出。

6 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

将得到的潜在靶标基因ID导入DAVID数据库，对其进行GO和KEGG通路的富集分析。首先选择满足P＜0.05且Q＜0.05的生物学过程和通路，使用Bioconductor平台及R语言绘制barplot柱状图和dotplot点图。

结 果

1 桂枝甘草汤活性成分的收集及潜在作用靶点预测

从TCMSP中共获取甘草的活性成分280种，桂枝的活性成分220种。筛选后甘草活性成分92种，桂枝的活性成分7种，其中甘草活性成分中18α-羟基甘草次酸等四种成分未找到对应靶点，桂枝活性成分中过氧麦角甾醇未找到对应靶点，故桂枝、甘草关键有效成分共94种。通过Uniprots数据库获得202个候选靶标的对应基因。检索GeneCards数据库和OMIM数据库中有关室性期前收缩的相关靶基因，得到3101个疾病相关基因，与药物靶基因相映射，绘制Venn图，得出甘草-桂枝药对治疗室性期前收缩的潜在作用靶标一共145个，见图1。

图1 甘草-桂枝与室性早搏共同靶点基因

2 药物-成分-疾病靶标网络的构建与分析

使用Cytoscape3.8.2软件对桂枝甘草汤的活性物质和疾病靶点之间相互作用的关系等数据进行了网络架构，并做出了可视化的处理。该网络共包括241个节点，1241种相互关系。其中红色八边形代表疾病室性早搏，绿色菱形代表甘草、桂枝两种药物，黄色三角形代表药物的有效成分，绿色圆形代表药物与疾病相关的潜在作用靶标。连线代表其相互关系，见图2。

图2 关键活性成分与疾病靶标的网络

3 桂枝甘草汤靶标蛋白相互作用（PPI）网络的构建及分析

将桂枝、甘草中具有治疗室性早搏作用的潜在靶标导入STRING数据库，得到各蛋白之间相互作用的网络图，共145个节点和条边，结果以TSV格式导出，然后使用R语言将每个靶标的相邻节点数排序，将排名前30的靶标绘制为柱状图。其中AKT1的相邻节点数为105个，IL6的相邻节点数为98个，MAPK3的相邻节点数为92个，VEGFA的相邻节点数为92个，CASP3的相邻节点数为87个。可能为桂枝甘草汤治疗室性早搏的关键基因，见图3，图4。

图3 蛋白相互作用关系网络

图4 PPI网络核心基因

4 GO富集分析

GO富集分析产生的结果中，获得了180条生物学过程，用条形图的形式将排名前20位的生物过程表现出来。条形图中，颜色越红，说明富集越明显。主要为RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、DNA结合转录因子结合、配体激活的转录因子活性、磷酸酶结合、核受体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合等生物学过程相关。可见桂枝甘草汤可通过多种生物学过程减少室性早搏的发生，见图5。

图5 甘草-桂枝治疗室性早搏潜在作用靶标的GO富集

5 KEGG富集通路分析

使用DAVID数据库对甘草-桂枝活性成分对应的潜在靶标进行通路分析，获得170条通路，将前20条通路绘制条形图。条形图中，颜色越红，则富集越明显，主要涉及的通路有糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路以及HIF-1信号通路等，表明桂枝甘草汤可通过多个靶点作用于不同通路治疗室性早搏。另外，乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、前列腺癌和胰腺癌、弓形体病、人巨细胞病毒感染、等多种通路提示桂枝甘草汤不仅可应用于室性早搏的治疗，还可应用于其他疾病，体现了异病同治理论，见图6。

图6 甘草-桂枝治疗室性早搏潜在作用靶标的KEGG富集通路

讨 论

室性早搏作为在我国在临床上最常见的心律失常疾病之一，其在普通人群中具有高达1%～4%的发病率[5]，且随年龄的增长而增加，病因包括器质性疾病和功能性障碍，心脏器质性病变、自主神经重构及失衡、交感神经的兴奋性增高、先天心内结构发育不良、药物中毒以及电解质紊乱等引起心室肌自律性增高，致使提前触发除极活动，以及局部微小折返环，从而引起室早[6-9]。

器质性病变导致室早的患者，应积极地治疗本病的病因，而无器质性病变的室早患者，应首先给予生活指导，如在临床上症状没有明显好转时应及时给予其他药物治，如β受体阻滞剂、非二氢吡啶类钙通道阻滞剂，但两种药物疗效有限，且有一定副作用。而导管消融治疗可作为频发室早症状明显患者的更优选择，但手术成功率与早搏起源部位的高度有关，故部分区域消融难度较大[10]。

近年来，经方治疗心律失常尤其功能性室性早搏的研究取得良好进展，室性早搏在祖国医学中属“心悸”“怔忡”的范畴，气、血、阴、阳不足，致心神失养，气滞、痰浊、血瘀阻于心脉而致气血运行不畅[11]，综合为本虚标实的病机，治疗上则虚者补气养心安神，实者理气消痰化瘀为基本治则[12]，桂枝甘草汤为《伤寒论》中治疗心悸病的基础方，且研究表明，基于数据挖掘技术，中医药治疗室性早搏最常用药对为甘草-桂枝药对，功能益气养血、复阳通脉，因中药复方在临床上治疗疾病的特点为整体观念和辨证论治，而网络药理学多成分、多靶点、多通道的特征与之紧密结合，为中医药现代化研究提供便利。

本文利用数据库筛选出甘草中异甘草素、槲皮素、山柰酚以及甘草酸类化合物等88种有效成分，异甘草素可通过抗氧化、抗炎、阻断电压依赖性钾电流通道和L型钙电流通道，控制或减少室性早搏的的发生，另外，甘草酸类物质通过抗氧化抗炎、阻断心血管细胞间隙连接，保护心肌并起到抗心律失常的作用[13]，山奈酚可以发挥抑制平滑肌细胞的增殖和迁移、抑制α-葡萄糖苷酶活性、抗糖化、抑制脂肪的合成和减轻急性肝损伤等作用[14]。刺芒柄花素具有抗肿瘤、抗炎、耐氧化、抗动脉粥样硬化等多种微生物学功能的特性[15-17]。花旗松素可发挥抑制NF-kB信号通路从而起到对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用[18]。槲皮素具有抗炎症、抗肿瘤、抗衰老、抗氧、舒张血管等多种生物学效应[19]。

丹皮酚、柚皮苷、槲皮素可作用于AKTI靶标基因，在PPI网络中处于网络中核心位置，AKT1蛋白在多种生物学过程中起作用，包括增殖、代谢、细胞存活和生长等，AKT信号通路是可起到调节细胞增殖和凋亡作用的重要信号通路[20]，抑制AKT1的正常表达能对心肌细胞起到一定保护作用[21]。筛选出桂枝中花旗松素、β-谷甾醇、谷甾醇、（+）-儿茶素、（+）-表儿茶素、紫杉叶素6种有效成分，实验研究表明，桂枝对大鼠有较强的抗焦虑和镇静的作用，可通过降低大鼠的交感神经兴奋性达到减少室性早搏发生的次数[22]。且研究表明桂枝甘草汤可在一定程度上抑制Na+通道，该方抗心律失常的主要作用机制可能与I类抗心律失常药物的作用相一致[23]。多种成分作用于白介 素 6（IL6）、MAPK3、VEGFA、CASP3、EGF、JUN等多种靶标基因，激活AGE-RAGE、TNF、IL-17等信号通路，通过作用DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性等生物学过程，通过保护心肌细胞，调节细胞增殖和凋亡，改进自主神经功能，抑制交感神经兴奋，从而有效减少室性早搏的发生。