蔡达 王玉涛 王文博
摘要:为快速、准确定性定量十字花科蔬菜中的活性成分莱菔素与莱菔硫烷,本试验建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定萝卜、西兰花、白菜中莱菔素与莱菔硫烷含量的方法。采用水解-乙酸乙酯提取莱菔素和莱菔硫烷,WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(100mm ×2.1mm,1.7μm)分离,流动相A为0.1%甲酸-水溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱,质谱采用电喷雾正离子(ESI+)电离,多反应监测扫描模式(MRM)。莱菔素与莱菔硫烷在5~500μg/L浓度范围内具有良好的线性关系,添加回收率分别在82.09% ~107.42%、89.79% ~105.55%,相对标准偏差(RSD)分别在2.16% ~4.80%、1.52% ~4.96%,检出限分别为0.5、0.4μg/L。该方法准确度、精密度和灵敏度均满足定性定量分析的要求,可以准确测定十字花科蔬菜中莱菔素和莱菔硫烷的含量。
关键词:十字花科蔬菜;莱菔素;莱菔硫烷;超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号:TS207.3 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2022)01-0144-08
十字花科植物因花冠呈十字型而得名,属于双子叶植物纲,五桠果亚纲,白花菜目中的一科,约有388个属,3700余种,现已被引种到世界各地。常见的十字花科蔬菜主要有芸薹属的白菜、西兰花、甘蓝,以及萝卜属的萝卜等。流行病学研究发现,十字花科蔬菜具有防癌抗癌的作用,随着十字花科蔬菜摄入量的增加,可以明显降低多种恶性肿瘤的发病风险,包括肺癌、肝癌、结肠癌等[1-4],此外,十字花科蔬菜还有抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病的功效[5-9],具有重要的营养保健价值,备受广大消费者青睐。
与其它蔬菜相比,十字花科蔬菜突出的防癌抗癌功效主要归功于其含有大量的异硫氰酸酯类物质,如莱菔素和莱菔硫烷等[10]。莱菔素[(4-异硫氰酸基-1-(甲基亚磺酰基)-1-丁烯,分子式C6H9NOS2)]和莱菔硫烷(1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷,分子式C6H11NOS2)在化学结构上仅相差一个双键。目前发现,莱菔素主要来源于萝卜,其在萝卜种子中的含量高达7mg/g[11],因此萝卜又名莱菔。而莱菔硫烷主要来源于西兰花及其种子[12],在西兰花花球、茎、叶片中的含量分别为1.782、0.436、0.204μmol/g[13]。已有研究表明,莱菔素和莱菔硫烷对结肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和胃癌等均有明显的抑制作用[14-20],两者还具有抗炎抑菌、提高机体抗氧化能力和免疫力等功能活性[21-23]。因此,莱菔素和莱菔硫烷含量被视为评价十字花科蔬菜品质和营养保健价值的重要指标。
莱菔素和莱菔硫烷检测方法主要有化学滴定法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等[24-32]。其中,化学滴定法、分光光度法步骤繁琐,检测灵敏度较低;气相色谱法在检测过程中高温会破坏莱菔素和莱菔硫烷的结构,定量准确度不高;高效液相色谱法仅以出峰时间定性,对这两种分子结构相近的物质难以实现基线分离,无法同时定性定量检测,且洗脱时间较长,检测较为耗时。而超高效液相色谱-串联质谱法(UPLCMS/MS)准确度和灵敏度较高,分析时间短,能同时测定十字花科蔬菜中的莱菔素和莱菔硫烷。目前国内外相关研究主要集中在单独测定莱菔素或莱菔硫烷方面[24-32],尚未发现基于UPLC-MS/MS同时测定莱菔素和莱菔硫烷的研究报道。因此,本研究选择具有代表性的样品萝卜、西兰花、白菜作为研究对象,建立基于UPLC-MS/MS技术的十字花科蔬菜中莱菔素和莱菔硫烷含量分析方法,对于莱菔素和莱菔硫烷的快速、准确检测具有重要价值,同时可为十字花科蔬菜优异种质挖掘和异硫氰酸酯类活性成分产品开发及蔬菜产品营养品质和保健功能提升提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 仪器设备
WatersACQUITYUPLC超高效液相色谱系统,美国Waters公司;ABSCIEXQTRAP5500三重四极杆串联质谱仪,美国ABSCIEX公司;高速冷冻离心机,北京京立离心机公司;RV10旋转蒸发仪,MS3涡旋混合器,匀浆机,德国IKA公司;FA2204分析天平,上海上平仪器有限公司;Milli-Q超纯水机,美国Millipore公司。
1.2 试验材料与试剂
莱菔素标准品,纯度≥98%,美国Sigma公司;莱菔硫烷标准品,纯度≥95%,美国Sigma公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯,色谱纯,美国Fisher公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.3 标准溶液配制
称取莱菔素和莱菔硫烷标准品各5.00mg,用甲醇溶解,分别转移至5mL容量瓶中,定容至刻度,得到质量浓度为1000mg/L莱菔素和莱菔硫烷单标储备液,于-20℃避光保存。将标准储备液用甲醇逐级稀释成500、100、50、10、5μg/L的混合标准工作溶液。
1.4 样品制备
采用四分法分取样品,取约200g新鲜样品于匀浆机中匀浆均匀,编号,置于-20℃保存,备用。
1.5 莱菔素和莱菔硫烷的提取
称取蔬菜匀浆样品0.200g于50mL离心管中,分别加入3mLpH5.0的磷酸缓冲液、pH5.6的磷酸缓冲液、pH6.2的磷酸缓冲液、pH6.8的磷酸缓冲液,混匀,置于25℃水解1h,然后加入乙酸乙酯40mL,萃取30min,以4500r/min离心5min,取上层有机相,置于旋蒸瓶中,再重复萃取2次,合并萃取液,旋轉蒸发至近干,用20mL甲醇水溶液(甲醇∶水=7∶3,V/V)定容,过0.22μm滤膜,待UPLC-MS/MS分析测定。
1.6 仪器测定条件
1.6.1 色谱条件 为优化色谱条件,分别选用WatersACQUITYUPLCBEHC8色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)、WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)和Symmetry300C18色谱柱(75mm×4.6mm,3.5μm)3种不同色谱柱。柱温:40℃;流动相A:0.1%甲酸-水溶液;流动相B:乙腈;流速:0.3mL/min;进样体积:2.0μL;梯度洗脱程序如表1所示。
1.6.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI);正离子模式;离子源温度(TEM)450℃;雾化气压力(GS1)89.6kPa;气帘气压力(CUR)137.9kPa;电喷雾电压(IS)5500V;驻留时间100ms。采用多反应监测扫描模式(MRM),以获取莱菔素与莱菔硫烷的最佳检测条件。
1.7 定量分析
分别取标准溶液和样品溶液上机测定,通过标准工作液的浓度与相应的色谱峰面积绘制标准曲线,以样品溶液中莱菔素或莱菔硫烷的峰面积代入标准曲线,从而得到相应的莱菔素或莱菔硫烷的浓度。
1.8 数据分析
试验平行测定3次,结果用均值表示。采用SPSS22.0软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的选择
通过蠕动泵恒流注射进样1mg/L的莱菔素和莱菔硫烷单标溶液,分别进行全扫描,得到准分子离子。结果显示,莱菔素和莱菔硫烷的母离子分别是m/z176.0、m/z178.1。之后分别对确定的母离子进行子离子扫描,通过优化碰撞能量,获得二级特征碎片离子。结果发现,莱菔素的主要特征碎片离子为m/z112.0、m/z78.1,如图1(a)所示。莱菔硫烷的主要特征碎片离子为m/z114.1、m/z72.0,如图1(b)所示。在MRM模式下,优化去簇电压和碰撞能量,最终得到莱菔素和莱菔硫烷的监测离子对和最佳参数,如表2所示。
2.2 色谱柱的选择
试验结果显示,WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(100mm ×2.1mm,1.7μm)分离效果明显优于另外两种柱子,峰对称性较好,具有良好的峰形和稳定的柱效。因此,选择C18(100mm ×2.1mm,1.7μm)作为分离色谱柱。
2.3 流动相条件的选择
由于甲醇和水比例接近1∶1时,混合溶液粘度大,色谱柱柱压高,为降低柱压,延长色谱柱使用寿命,故选择乙腈和水作为流动相,同时加入0.1%甲酸以改善峰形。梯度洗脱程序如表1时,莱菔素和莱菔硫烷的响应值较高,峰形较好,基线稳定,无杂质干扰,且分析时间较短。莱菔素和莱菔硫烷标准溶液和样品溶液选择离子色谱图分别如图2、图3所示。
2.4 提取条件的选择
莱菔素和莱菔硫烷的前体物质硫代葡萄糖苷在不同pH条件下生成的水解产物不同,在中性偏酸性条件下,水解产物以异硫氰酸酯类为主,而莱菔素和莱菔硫烷均属于该类物质。有研究显示,当水解pH 为5左右时,莱菔素提取率最高[33],而莱菔硫烷的最适pH一般在6~7之间[34]。本研究考察了不同水解pH值对提取效果的影响,如表3所示。结果表明,pH5.6条件下,莱菔素和莱菔硫烷的提取效果较好,且添加回收率和相对标准偏差(RSD)均可满足定量分析的要求。
2.5 方法的线性范围
以浓度为500、100、50、10、5μg/L的莱菔素和莱菔硫烷混合标准工作溶液,绘制色谱峰面积对浓度的标准曲线(图4)。在5~500μg/L浓度范围内,莱菔素和莱菔硫烷的标准曲线线性关系均良好。
2.6 方法的准确度、精密度和灵敏度
方法的准确度和精密度通过添加回收试验进行考察。在萝卜、西兰花、白菜中分别添加低、中、高3个浓度水平的莱菔素和莱菔硫烷标准溶液,每个浓度均做5个平行,进行3水平5平行加标回收试验。由表4可知,在1~60μg/g添加水平下,莱菔素添加平均回收率在82.09% ~107.42%之间,RSD为2.16% ~4.80%。由表5可知,在5~80μg/g添加水平下,莱菔硫烷添加平均回收率在89.79% ~105.55%之间,RSD为1.52% ~4.96%。
逐步稀释样品上机测定,以信噪比S/N≥3计算检出限,莱菔素的检出限为0.5μg/L,莱菔硫烷的检出限为0.4μg/L。上述结果表明,回收率、精密度和灵敏度均满足定性定量分析的要求。
2.7 实际样品中莱菔素和莱菔硫烷的分析检测
选取3种有代表性的十字花科蔬菜样品萝卜、西兰花、白菜,按照上述已建立的方法进行分析测定,结果如表6所示。萝卜中的莱菔素含量较高,为38.59μg/g。西兰花中的莱菔硫烷含量较高,为22.06μg/g,而莱菔素含量低于检出限。白菜中的莱菔素和莱菔硫烷含量均相对较低。
3 讨论
利用本试验建立的方法对实际样品进行分析检测,发现萝卜中的莱菔素含量较高,为38.59μg/g。莱菔素在萝卜中的含量远远高于其它蔬菜,是萝卜中主要的异硫氰酸酯类化合物[33]。华贝贝等[30]研究表明,不同产地、不同品种萝卜中莱菔素含量存在显著差异,莱菔素含量分布范围为34~1447mg/kg。姚玉庆[31]对43个不同品种萝卜中莱菔素含量进行了分析,发现其含量变化范围为43.26~468.27μg/g。本研究中萝卜样品的莱菔素含量相对略低,可能与萝卜品种、产地环境包括温度、土壤条件、日照长短及强度等不同有关[35]。莱菔硫烷是西兰花中最主要的异硫氰酸酯类物质,本试验对西兰花样品的分析检测表明,西兰花中莱菔硫烷含量较高,为22.06μg/g,而莱菔素含量低于检出限。杨杜等[36]对西兰花中异硫氰酸酯进行分析鉴定,也未检出莱菔素。Liang等[37]分析发现西兰花中莱菔硫烷的含量在1.4~32.9mg/kg之间;孔凡华等[32]研究显示西兰花中莱菔硫烷含量为每100g中3.86mg,与本研究测定结果大致相当。对白菜样品进行分析检测发现,白菜中的莱菔素和莱菔硫烷含量均较低,与廖永翠等[38]的研究结果一致。
国内外关于莱菔素和莱菔硫烷检测方法的研究报道主要集中在单独测定莱菔素或莱菔硫烷方面[24-32],目前仅发现1篇研究报道建立了HPLC法同时测定莱菔素和莱菔硫烷[39]。在该报道中,通过在流动相中加入四氢呋喃,提高了莱菔素和莱菔硫烷的分离度,但是四氢呋喃会对色谱柱和仪器产生较为严重的损伤;此外,该方法洗脱时间较长,需要30min,检测效率较低。尚未发现利用UPLC-MS/MS同时测定莱菔素和莱菔硫烷的研究报道。由于UPLC-MS/MS具有更高的靈敏度和准确度,且分析时间较短,因此在同时测定莱菔素和莱菔硫烷方面具有明显的优势。对此,为了解决莱菔素和莱菔硫烷分析检测中存在的问题,本研究首次建立了基于UPLC-MS/MS同时检测十字花科蔬菜中莱菔素与莱菔硫烷含量的方法,可为十字花科蔬菜营养评价及育种研究提供技术支持。
4 结论
本研究建立了UPLC-MS/MS同时检测十字花科蔬菜中莱菔素与莱菔硫烷含量的方法。确定色谱条件为WatersACQUTTYUPLCBEHC18色谱柱(100mm × 2.1mm,1.7μm),乙腈-(0.1%甲酸)水溶液作为流动相,梯度洗脱,流速0.3mL/min。质谱采用ESI+模式,MRM扫描模式。莱菔素和莱菔硫烷在5~500μg/L浓度范围内均与峰面积具有良好的线性关系。莱菔素、莱菔硫烷的添加回收率分别为82.09% ~107.42%、89.79% ~105.55%,RSD分别为2.16% ~4.80%、1.52% ~4.96%。莱菔素、莱菔硫烷的检出限分别为0.5、0.4μg/L。该方法前处理简单、分析时间较短,准确度、精密度和灵敏度均满足定性定量分析的要求,适用于十字花科蔬菜中莱菔素和莱菔硫烷含量的测定。