B细胞异位基因2在胰腺癌组织中的表达及临床意义

袁中电 吴红伟 沈丰 孙少华 武伦 高嘉良 刘一魁 周文波

1锦州医科大学国药东风总医院研究生规培基地肝胆胰外科 ，十堰 442000；2湖北医药学院附属国药东风医院肝胆胰外科，十堰 442000

B细胞异位基因(B cell translocation gene)家族，即BTG家族，作为公认的抑癌基因，被发现于上世纪90年代，BTG2是该家族中首个被鉴定并定位的抑癌基因[1]。BTG2的N-末端结构域包含两个保守的基因系列，被命名为A盒基因序列和B盒基因序列，其中A盒具有抗增殖的作用，将细胞捕获在G1/S期[2]，而B盒则可以与许多靶分子结合，参与细胞分裂、DNA修复、转录调控和信使RNA的稳定性等过程[3-4]。BTG2在人体组织中广泛表达，在胰腺、前列腺、肺等器官中高表达。近几年研究证实，BTG2在肝癌[5]、前列腺癌[6]等多种肿瘤组织中表达下调，其作为一种抑癌基因在肿瘤细胞的增殖、分化以及DNA损伤修复中起重要作用。但其是否参与胰腺癌的发生和发展鲜有报道。本研究通过检测BTG2在胰腺癌组织中的表达情况，探讨其在胰腺癌中的作用机制及临床意义。

资料与方法

一、一般资料

收集2015年6月至2020年12月间湖北医药学院附属东风总医院病理科石蜡封存的46例胰腺癌组织、对应的癌旁组织及肝胆胰外科9例行手术切除的新鲜胰腺癌组织、对应的癌旁组织(距肿瘤边缘2 cm以上)，记录患者的年龄、性别、CA19-9水平、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、是否血管侵犯及淋巴结转移等。

二、胰腺癌及癌旁组织BTG2蛋白表达检测

采用免疫组织化学染色法检测石蜡封存的胰腺癌组织及癌旁组织BTG2表达情况。将46例胰腺癌组织石蜡标本制成厚度为4 μm切片，按照试剂盒说明书进行操作。兔抗人 BTG2抗体购自英国abcam公司，工作浓度1∶50，山羊抗兔IgG二抗购自上海碧云天生物技术有限公司，工作浓度1∶200。由两名病理科医师盲法独立阅片，胞质中出现棕黄色或者褐色颗粒定为BTG2表达阳性细胞。根据BTG2染色深度及阳性细胞百分比进行评分：无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞比例<10%计1分，10%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。两者得分相乘，积分≥4分为高表达，<4分为低表达[7]。依据BTG2表达水平，将46例胰腺癌组织及癌旁组织分为高表达组和低表达组。

三、胰腺癌及癌旁组织BTG2基因表达量检测

采用荧光定量PCR法检测9例新鲜胰腺癌组织及癌旁组织BTG2的表达量。取9例液氮冻存胰腺癌及癌旁组织，解冻后用Trizol提取组织总RNA，紫外线分光光度仪测定RNA纯度及浓度。先将RNA逆转录成cDNA，按反转录试剂盒说明书操作，荧光定量试剂盒购自英国abcam公司。BTG2正向引物序列为5′-CATCATCAGCAGGGTGGC-3′，反向引物序列为5′-CCCAATGCGGTAGGACAC-3′；内参GADPH正向引物序列为5′-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3′，反向引物序列为5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3′。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。RT-PCR反应条件： 50℃ 2 min、95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 59 s，40个循环。通过PCR仪器自带软件获取扩增产物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt计算组织BTG2相对表达量。每个样本重复实验3次，取平均值。

四、随访

患者出院后通过来院复查随访或进行电话随访。随访截至 2020年12月31日，随访时间为75～835 d，中位随访时间为387 d。

五、统计学处理

结 果

一、胰腺癌及癌旁组织BTG2表达

BTG2蛋白在胰腺癌组织及癌旁组织中均为弥散性胞质表达(图1)。46例胰腺癌组织中BTG2高表达29例(63.04%)，低表达17例(36.96%)；对应癌旁组织中BTG2高表达38例(82.61%)，低表达8例(17.39%)，癌旁组织BTG2高表达率显著高于癌组织，差异有统计学意义(χ2=4.45，P=0.035)。

图1 BTG2蛋白在胰腺癌组织(1A)和癌旁组织(1B)中的表达 (免疫组织化学 ×200)

9例胰腺癌组织中3例为高分化，6例为中低分化。高分化胰腺癌组织BTG2表达量显著高于中低分化癌组织(0.66±0.07比0.24±0.18)，癌旁组织表达量显著高于癌组织(1.00±0.00比0.38±0.30)，差异均有统计学意义(t值分别为5.15、-7.32，P值均<0.001)。

二、BTG2蛋白表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系

46例胰腺癌组织BTG2阳性表达率与肿瘤分化程度、血管侵犯有关，而与肿瘤位置、肿瘤长径、CA19-9水平、淋巴结转移、术后肝转移无关(表1)。

表1 46例胰腺癌组织BTG2蛋白表达水平与临床病理特征的关系[例(%)]

三、BTG2蛋白表达水平与胰腺癌患者预后的关系

BTG2高表达组中位生存期为525 d，BTG2低表达组中位生存期为266 d，差异有统计学意义(P<0.001，图2)。死亡风险曲线图显示，生存<300 d患者BTG2高表达组与低表达组生存时间差异无统计学意义[(179±69)d比(160±72)d，t=0.58，P=0.571]；生存≥300 d患者BTG2高表达组生存时间显著长于BTG2低表达组[(616±135)d比(426±113)d]，差异有统计学意义(t=3.50，P<0.001，图3)。单因素分析结果显示，肿瘤分化程度、CA19-9水平、血管侵犯、术后肝转移、BTG2表达水平是影响胰腺癌患者预后的因素；多因素Cox模型分析结果显示，BTG2表达水平、血管侵犯、术后肝转移是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素(表2)。

图2 BTG2蛋白表达水平与胰腺癌患者生存时间的关系

图3 不同BTG2蛋白表达水平胰腺癌患者的死亡风险曲线

表2 46例胰腺癌患者预后的单因素及多因素分析

讨 论

BTG2位于1号染色体长臂的3区2带上，共编码158个氨基酸，最初被鉴定为p53诱导基因，其表达受p53依赖机制的调控[8]。此外，BTG2也可以抑制cyclin E的表达，并在无p53、Rb和cyclin D1参与下抑制细胞G1/S期的跃迁[9]。研究证实，肺癌[10]、喉癌[11]、乳腺癌[12]等多种肿瘤组织BTG2表达均明显下调，并通过多种途径参与肿瘤细胞的增殖、转移。本研究结果显示，胰腺癌组织BTG2表达阳性率及相对表达量显著低于癌旁组织，高分化胰腺癌组织表达量显著高于中低分化组织，提示胰腺癌BTG2表达明显下调，低表达是胰腺组织恶性表型的重要征象之一。

Devanand等[12]发现，BTG2可以通过抑制癌细胞的侵袭和转移，也可以通过表观遗传学沉默减缓肿瘤向周围组织浸润性生长，是治疗碱性螺旋-环-螺旋转录因子1高表达的转移性肿瘤的潜在靶标。本研究结果显示，BTG2低表达与肿瘤分化程度低、血管侵犯有关，提示BTG2可能是抗衡胰腺癌侵袭性的潜在靶点，与BTG2在骨肉瘤[13]、宫颈癌[14]的相关研究结果一致。

Zubair等[11]报道，实体肿瘤中BTG1或BTG2的表达降低通常与恶性细胞行为和不良治疗结果相关，其基因产物的表达情况可作为疾病进展的生物标记。文献报道，BTG2蛋白的表达水平可作为多种癌症的预后生物标志物，比如三阴性乳腺癌[15-16]、喉癌[17]、肝癌[18]。Wang等[19]报道，BTG2表达水平是影响食管鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素，BTG2的下调可用作鉴定和预测食管癌进展和放射敏感性的分子标志物。本研究结果显示，BTG2高表达组中位生存期显著长于BTG2低表达组，提示BTG2高表达能显著改善患者预后，术后300 d后BTG2低表达组患者死亡风险随生存时间延长显著高于高表达组，说明BTG2对胰腺癌预后的影响主要发生在远期。单因素分析结果显示，肿瘤分化程度、CA19-9水平、血管侵犯、术后肝转移以及BTG2表达水平均与预后有关。多因素分析结果显示，血管侵犯、术后肝转移、BTG2表达水平为影响胰腺癌患者预后的独立危险因素，即BTG2低表达提示预后较差。

综上所述，BTG2在胰腺癌组织中表达下调，与胰腺癌的恶性生物学行为相关，BTG2表达水平是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素，其影响主要发生在远期。但本研究纳入BTG2定量分析例数较少，且缺乏表观遗传学研究，尚需大样本以及纳入更多因素的研究予以进一步验证。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明袁中电：实验设计、实验操作、数据统计、论文撰写；吴红伟、孙少华、沈丰：实验指导、统计学分析；高嘉良、刘一魁：数据统计；周文波、武伦：研究指导、论文修改、经费支持