解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白研究进展

周智博，王卿惠，郭欣欣，徐婧怡，苑世伟，陈彦龙，王世伟

解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白研究进展

周智博1，2，王卿惠3，郭欣欣1，2，徐婧怡1，2，苑世伟1，2，陈彦龙1，2，王世伟1，2

（齐齐哈尔大学 1. 生命与农林学院，2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3. 东北农业大学 生命科学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

解淀粉芽胞杆菌（）具有广泛的抑菌活性．在种植业、养殖业、果蔬采后病害防治、环保、食品安全等领域具有广泛应用前景，其菌体能产生多种抑菌蛋白．目前，国内外对解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的研究逐渐深入．综述了解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的研究，其中包括解淀粉芽孢杆菌菌株的生境多样性，解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌蛋白种类和作用效果，抑菌蛋白提取、纯化、鉴定及其初步的作用机制，以期对解淀粉芽孢杆菌的抑菌蛋白研究、应用及开发提供科学参考．

解淀粉芽孢杆菌；抑菌蛋白；纯化；抑菌机理

尽管化学防治是防治植物病虫害的有效措施，但随着农药的使用和农药残留量增加，给环境造成了巨大的污染和危害．生物防治符合绿色环保要求，无污染，高效节能，受到广泛重视[1]．解淀粉芽孢杆菌（）是一种益生菌，能产生多种抑菌蛋白．近年来，人们对其进行了大量研究，相关报道逐年增加，但报道较为分散，有必要总结归纳．本文对解淀粉芽胞杆菌产生的抑菌蛋白进行了综述，以期对其开发和应用提供参考．

1　解淀粉芽孢杆菌的生境多样性

解淀粉芽孢杆菌分布较广，具有丰富的生境多样性．自发现解淀粉芽孢杆菌可拮抗多种植物病原菌以来，研究人员从各个区域的作物、土壤、白酒大曲，甚至动物体内分离鉴定了多种解淀粉芽孢杆菌．如宁豫昌[2]等从健康猪肠道中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌，命名为MY-6．王伟[3]等从牡蛎中分离1株能产生抑菌活性物质菌株，经形态特征及16sRNA基因序列鉴定为解淀粉芽孢杆菌，命名为DH 8030．王世伟[4]等在北大仓白酒大曲中分离1株细菌M1-1，经传统显微镜技术结合16sDNA序列鉴定该菌为解淀粉芽胞杆菌．该菌对米曲霉和尖孢镰刀菌等植物病原菌均有较强的抑制作用．秦楠[5]等从玉米田土壤中分离到一株解淀粉芽孢杆菌HRH31，该菌能产抗菌肽．梁丽琼[6]等从柑橘根际土壤中分离鉴定了可抑制水稻基腐病菌（）EC1生长的解淀粉芽孢杆菌．Mushtaq[7]等从印度丹希冈（Dachigam）国家公园土壤中分离出一种新的能够产生碱性蛋白酶细菌（HM48），经鉴定也为解淀粉芽孢杆菌．可见，解淀粉芽孢杆菌具有丰富的生境多样性，这为解淀粉芽孢杆菌的分离、筛选和开发提供了坚实的基础．

2　解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌蛋白

解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌蛋白（Antagonistic protein）是由核糖体途径合成蛋白前体后，经过转运、翻译、修饰、跨膜运输、切除引导肽等过程形成的具有抗微生物活性的蛋白质或抗菌肽，是从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离的多种蛋白类拮抗物质，主要包括抗菌肽、细胞壁降解酶以及其它抑菌蛋白．

2.1　抗菌肽

抗菌肽（antibiotic peptide）是一类具有抗微生物活性的小分子短肽，能抵御其它病原微生物侵染，在防御反应中起重要作用，其中包括多种细菌素（bacteriocin）．细菌素多为环肽结构，耐热性强，对酸碱环境表现稳定，具广谱抑菌活性．王伟[8]等从解淀粉芽孢杆菌中提取了一种细菌素Amylocyclicin W5，它不仅能抑制蜡样芽孢杆菌（）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（），还可能对肠出血性大肠杆菌（O157：H7）产生抑制作用．Bindiya[9]等在解淀粉芽孢杆菌中分离和纯化了一种细菌素BaCf3BTSS3，它对一些食品腐败细菌的生长和生物膜形成具有抑制潜力，具有较强的pH和温度耐受性，但对氧化剂和还原剂较为敏感．该细菌素的序列分析显示，其C6和C13之间存在二硫键．微量滴定板实验证明，BaCf3可以减少高达80%的生物膜，同时对3-TL3细胞系没有细胞毒性．Regmi[10]等从发酵泡菜中筛选出与解淀粉芽孢杆菌同源高达99.79%的亚种FZB42（T），并从中纯化到分子量为4.6 kDa的抗菌肽CSpK14．该抗菌肽在pH 6.0～11.5，80 ℃下稳定，对各种金属离子、溶剂和蛋白酶也很稳定．具有广泛的抑制谱及抗生物膜的协同作用．可见，解淀粉芽孢杆菌合成的抗菌肽类蛋白质有比较独特的抗逆性，抗菌谱广泛，充分挖掘其抗菌肽蛋白对病原微生物的防治具有潜在价值．

2.2　细胞壁降解酶

解淀粉芽孢杆菌产生的细胞壁降解酶（Cell wall degrading enzyme）也是一种重要的抑菌蛋白，主要包括：几丁质酶、-1，3-葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和DEF-纤维素蛋白酶．苟艳[11]等以壳聚糖为唯一碳源从土壤中分离筛选出一株具有产壳聚糖酶能力的解淀粉芽孢杆菌MY001，其可直接分解几丁质，在几丁质资源清洁利用和农作物真菌病害生物防治方面具有重要潜能．郭继平[12]等从解淀粉芽孢杆菌发酵液中筛选到53种蛋白质，其中4种蛋白质参与了几丁质降解．-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，对真菌生长具有重要作用．-1，3-葡聚糖酶能够水解-1，3-葡聚糖成为葡萄糖和小分子寡糖．由于-1，3-葡聚糖酶在植物病原真菌的生物防治方面具有重要应用价值，因此受到人们的广泛关注[13]．Kim[14]等研究了解淀粉芽孢杆菌MET0908抑菌蛋白，其分子质量为40 ku，具有-1，3-葡聚糖酶活性，对黄瓜炭疽病具有拮抗作用．可见，降解真菌细胞壁的相关酶是解淀粉芽孢杆菌重要的抑菌蛋白，对其进行的研究将在植物病原真菌的生物防治中具有开发和应用潜力．

Rajaselvam[15]等从发酵的大豆中筛选出解淀粉芽孢杆菌菌株KJ10，其能分泌一种能溶解纤维蛋白的蛋白酶，该酶最适pH为8.0，在40～55 ℃范围内具有较高活性．刘宇[16]等用含羧甲基纤维素钠的培养基结合刚果红染色法，从玉米青贮饲料样品中筛选到一株产纤维素酶的益生菌，通过形态学和系统进化树鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌．其粗酶液的滤纸酶活为2.500 5×10-8mol/（s·mL），外切葡聚糖酶活性为2.167 1×10-8mol/（s·mL），内切葡聚糖酶活性为1.066 88×10-7mol/（s·mL），-葡萄糖苷酶活性为3.834 1×10-8mol/（s·mL）．该菌产生的纤维素酶可降解细胞壁，在抑制植物病原真菌方面具有一定的价值．

2.3　其它抑菌蛋白

解淀粉芽孢杆菌还能产生含50个氨基酸的抑菌蛋白，是主要的抑菌蛋白．这些抑菌蛋白对大部分蛋白酶、温度及酸碱性不敏感，其结构与化学性质较稳定，并可拮抗多种病原菌．近年来，科研工作者分离纯化了多种抑菌蛋白，只确定了其分子量及部分性质，但其立体结构和氨基酸序列尚有待进一步研究．王晓辉[17]等从解淀粉芽孢杆菌K1发酵液中获得一种分子量为55 kDa的抑菌蛋白，该蛋白可有效抑制灰霉病菌（）生长．王彪[18]等经硫酸铵沉淀、透析除盐等技术从解淀粉芽孢杆菌ASR-12发酵液中分离纯化了一种抑菌蛋白，经SDS-PAGE检测获得一条单一条带，通过计算，分子量约为50 kDa．王培松[19]采用硫酸铵分级沉淀从解淀粉芽孢杆菌MG-3发酵液中提取了粗蛋白，经DEAE-650C弱阴离子交换层析和Sephacry1 S-200凝胶层析的组合策略，纯化了粗蛋白，通过SDS-PAGE电泳检验证实该蛋白分子量约45 kDa．以枇杷焦腐病菌为供试菌株，验证该抑菌蛋白对枇杷焦腐病菌具有很好的抑制作用．Wang[20]等从解淀粉芽孢杆菌FS6培养液的上清液中纯化一种抑菌蛋白，经鉴定证实该蛋白属于LCI家族，命名为APC（2）．该蛋白对茄属植物及人参根腐病具有保护作用．可见，对解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的纯化是后续对其进行研究的基础，这些较大分子量的抑菌蛋白稳定性较好，一般对植物病原菌具有较强抗性．随着研究的深入，将使这类抑菌蛋白得到更好地开发利用．

3　解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的作用效果

3.1　对真菌的作用

解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白能直接抑制病原性真菌．Qin[21]等从解淀粉芽孢杆菌HRH317中分离一种抑菌蛋白，分子量为36 kDa，并经牛津杯法检测了抑菌蛋白的活性．研究发现，该蛋白的抗菌谱较广，尤其对水果腐败霉菌有较好的抑制作用．Xu[22]等研究发现，解淀粉芽孢杆菌MQ01对尖孢镰刀菌、核盘菌、增殖镰刀菌、轮枝孢子菌、胶孢炭疽菌、雪花小孢子菌、木贼镰刀菌、半盖镰刀菌8种植物病原体具广谱抗真菌活性．提取其抗真菌物质，经分离鉴定、蛋白质同源性分析，证明其2种拮抗蛋白类物质为几丁质结合蛋白和枯草杆菌蛋白酶．Xu[23]等对纯化的解淀粉芽孢杆菌H6ZTE138蛋白进行了序列比对，证明其为一种蛋白酶，属于辅酶A硫酯酶的YBGC/FADM家族．该蛋白可裂解禾谷镰刀菌产生的真菌毒素ZEA．Fan[24]等从解淀粉芽孢杆菌MG-3中分离得到抗真菌蛋白MG-3A ，通过纯化鉴定可能是一种丝氨酸蛋白酶，分子量接近48 kDa，表现出广泛的抗真菌谱，可有效延长枇杷果实保质期至25 d．Fang[25]等从解淀粉芽胞杆菌CMN1308中分离出一种抗真菌蛋白，分子量为22.4 kDa，鉴定为几丁质结合蛋白，可以降解真菌细胞壁中的几丁质成分．可见，很多从解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌蛋白的抑菌作用均具有宽泛的抑菌谱．这些抑菌蛋白的后续研究将对植物病原菌的生物防治具有巨大价值．同时，也为研究真菌-植物-解淀粉芽孢杆菌的生态互作提供有针对性的科学参考．

3.2　对细菌的作用

解淀粉芽孢杆菌不仅对真菌有抑制作用，其中一些菌株的抑菌蛋白对细菌也产生抑制作用．朱永明[26]等研究发现，解淀粉芽孢杆菌B-4M-6菌株胞外产的抑菌蛋白能抑制肠道大肠杆菌、沙门氏菌的生长，并且能够产生各种消化酶促进肠道的消化吸收．Mukherjee[27]等纯化出的抑菌蛋白属于碱性蛋白酶，可以抑制肠道产细菌病原菌作用，以此来预防鱼类肠道疾病．目前，解淀粉芽孢杆菌抑制细菌的蛋白活性物质的研究报告的逐年增多，研究也不断深入，对解淀粉芽孢杆菌产生的能抑制细菌的抑菌蛋白的研究、开发和利用，将不断拓宽解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白在食品和果蔬保藏等领域的应用范围，具有潜在的应用价值．

4　解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的分离纯化与鉴定

4.1 解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的分离纯化

抑菌蛋白的分离纯化是研究其结构、功能、性质的基础．解淀粉芽孢杆菌分泌产生的抑菌蛋白可采用凯氏定氮法[28]进行粗蛋白含量测定．粗提抑菌蛋白的方法主要包括：酸碱沉淀法、硫酸铵沉淀法等．针对抑菌蛋白特性，可选择不同的提取方法．目前，对抑菌蛋白的分离和精制多采用硫酸铵盐析后分步柱层析，包括离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等[29-32]．对经纯化得到的抑菌蛋白，可通过SDS-PAGE对其进行分子量测定．陈宝莉[33]等从解淀粉芽孢杆菌中克隆得到新型-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，成功构建了含重组质粒的转化细胞．细胞经振荡培养，离心收集上清液后，再经超声波破碎收集细胞的上清液，使用Ni-IDA亲和层析进行重组蛋白纯化，洗脱并收集目的蛋白，用SDS-PAGE电泳对蛋白分子质量进行检测．Zhu[34]等采用硫酸铵沉淀法分离解淀粉芽孢杆菌发酵液中的主要抑菌物质，经DEAE琼脂糖凝胶快速流动弱阴离子交换层析和葡聚糖凝胶G-50分子筛层析纯化后，获得分子量约29.0 kDa的抑菌蛋白．可见，解淀粉芽孢杆菌的抑菌蛋白纯化同其它蛋白质纯化的方法大同小异，可以先进行硫酸铵或酸沉淀，然后根据抑菌蛋白活性，再经过各种层析方法对粗提取的抑菌蛋白进行精制．通过SDS-PAGE对抑菌蛋白的纯度进行检验，测定抑菌蛋白的分子量等相关参数，为抑菌蛋白的鉴定奠定基础．

4.2　解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的鉴定

解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白纯化后需要对其进行分析与鉴定．确定抑菌蛋白常采用质谱法，该方法主要能测定蛋白质一级结构，包括蛋白质的分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，这些研究对抑菌蛋白的结构分析十分重要[35]．同时，质谱技术常与液相色谱联用分析复杂的抑菌蛋白质．根据离子源的不同，质谱可分为电喷雾离子化质谱（ESI-MS）、热喷雾离子化质谱（HEI-MS）、二次离子质谱（SIMS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等．在进行蛋白质鉴定时，可根据所测数据用不同的软件进行检索、比对，进而对未知蛋白进行鉴定[36]44．Zhao[37]等发现解淀粉芽孢杆菌GSBa-1能产一种新型凝乳酶（MCE），经纯化并经LC-MS/MS将其鉴定属于肽酶M4家族，分子量约为38 kDa．Fang[25]等从CMN1308中提取的真菌蛋白，通过在分离凝胶中添加尿素的Tricine-SDS-PAGE电泳进行了分离．经过质谱分析和蛋白质表征，发现分离的真菌蛋白在M/Z处显示最大离子峰为2 679，分子量为29.5 kDa，与蛋白质鞭毛蛋白匹配．细胞外抑菌蛋白菌株CMN1308的尿素-Tricine-SDS-PAGE电泳后显示4个条带，而在质谱分析后仅鉴定出2个条带．带“A”的最大离子峰M/Z为1 926，分子量为49.8 kDa，经NCBI数据库对比，与DLDH（二氢硫辛酰胺脱氢酶）匹配．带“D”显示M/Z处的最大离子峰为2 936，分子量为22.4 kDa，与几丁质结合蛋白相匹配．可见，使用在蛋白质结构分析以及多肽氨基酸特异性序列分析中LC-MS和MS-MS串联方法应用较多．这些方法灵敏，分辨率较高，甚至仅用一段多肽就能鉴别蛋白质的类型[36]44，可用于解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的分析和鉴别．

5　解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白抑菌机制

解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白主要通过2种方式抑制病原菌生长，一是抑制侵染器官的解淀粉芽孢杆菌分生孢子形成；二是通过水解病原菌细胞壁或改变细胞膜透性，使细胞内容物外泄，菌丝断裂，抑制病原菌生长．

5.1　抑制菌丝生长和孢子萌发

病原菌主要靠分生孢子侵染植物，而解淀粉芽孢杆菌可以使菌丝发生畸形，菌丝细胞膨大甚至破裂，导致菌丝不能正常产生分生孢子．王彪[38]等采用牛津杯法检测了解淀粉芽孢杆菌ASR-12粗蛋白对8种病原真菌的抑制作用，同时以小麦雪腐病原菌作指示菌，观察粗蛋白对病原菌的抑制作用．结果表明，该抑菌蛋白耐高温、耐紫外，最适pH为7.0，对蛋白酶K和胰蛋白酶不敏感；同时可以抑制大白菜软腐病菌和8种病原真菌．通过抑制真菌孢子的萌发，降解真菌菌丝的细胞壁，造成菌丝畸形、膨大、扭曲．Zhang[39]等从解淀粉芽孢杆菌6256分离纯化出抗真菌肽P657，对胰蛋白酶和蛋白酶K具有抗性，25 ℃培养24 h后，在体外能完全抑制灰葡萄孢的孢子萌发．可见，解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的抑菌机理研究是初步的，但抑菌蛋白对真菌性病原菌孢子萌发及破坏菌丝的生长是抑菌作用的重要机制．

5.2　影响病原菌细胞膜和细胞壁

解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的抑菌机理也可能是通过破坏真菌细胞的结构实现．王伟[8]等以蜡样芽孢杆菌（LMGT2805）为指示菌对解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌蛋白的抑菌机理进行探讨，通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜研究了真菌细胞形态变化以及细胞内部结构变化．结果表明，抑菌蛋白的主要抑菌机制是破坏其细胞壁，使其形成孔洞，导致其内容物外泄，使细菌（营养或芽孢细菌）无法正常代谢，从而造成细菌的死亡．Xu[22]等研究发现，解淀粉芽孢杆菌MQ01对8种植物病原菌显示出广谱抗真菌活性，提取抗真菌物质，通过分离鉴定及蛋白质同源性分析，表明2种拮抗蛋白类物质为几丁质结合蛋白和枯草杆菌蛋白酶．这2类抑菌蛋白的协同作用，可使病原菌的细胞壁发生破坏，从而提高了植株对病原真菌的抵抗力[40]．总之，解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的抑菌机理可能是通过降解病原菌细胞壁或细胞膜，破坏病原菌细胞结构，使病原菌死亡，达到抑制真菌的目的．这些机理的研究是初步的，还需要深入分析和研究，从而进一步阐明解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白的抑菌机制．

6　展望

随着生物技术的发展，在生物防治领域，解淀粉芽孢杆菌作为一种生物防治益生菌代替传统化学制剂势在必行．解淀粉芽孢杆菌广泛存在于自然界，并且其在众多研究领域的应用具有独特的优势．随着研究该菌产生的抑菌蛋白的报道增多，将对其抑菌蛋白有更深入的了解．分离提纯解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白、阐明其复杂的抑菌机理具有重要的研究意义．随着蛋白质组学和基因组学在微生物领域的应用，解淀粉芽孢杆菌产生抑菌蛋白的分离纯化、鉴定以及其抑菌机理的研究将更加明了，这势必能为“解淀粉芽孢杆菌-动植物-病原菌”三者之间“互作”关系的揭示提供更多的证据和数据，这无疑能使解淀粉芽孢杆菌在动植物病虫害、生物转化和生物肥等领域的应用潜力得到更好的发挥，并为农业、畜牧业、食品和医药等重要行业的开发和应用奠定基础．

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Research progress of antagonistic protein of

ZHOU Zhibo1，2，WANG Qinghui3，GUO Xinxin1，2，XU Jingyi1，2，YUAN Shiwei1，2，CHEN Yanlong1，2，WANG Shiwei1，2

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar，161006，China；3. School of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

has a wide range of antagonistic activities．It has a wide application prospects in the fields of planting，aquaculture，post harvest disease control of fruits and vegetables，environmental protection，food safety and so on．It can also produce a variety of antimicrobial proteins．At present，the research on its antagonistic protein is gradually in-depth around the world．Reviews the research on the antimicrobial proteins of，including the habitat diversity ofstrains，the types and effects of antimicrobial proteins produced by，the extraction and purification of antimicrobial proteins，the identification of antimicrobial proteins and their preliminary mechanism，in order to provide scientific reference for application and development of the antimicrobial proteins ofin related fields．

；antagonistic protein；purification；antagonistic mechanism

1007-9831（2022）04-0064-06

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.04.013

2021-12-30

2021年黑龙江省大学生创新创业训练计划资助项目（202110232101）

周智博（2001-），男，河南鹤壁人，在读本科生．E-mail：1178975020@qq.com

王世伟（1965-），男，山东肥城人，教授，博士，从事微生物遗传与发酵工程研究．E-mail：wsw888535@sohu.com