细胞疗法治疗大便失禁的现状及展望

陈文斌 李旺林

华南理工大学附属第二医院，广州市第一人民医院结直肠肛门外科(广州 510180)

大便失禁是指直肠内容物(气体、固体或液体粪便)反复不自觉地通过肛门，并且无法推迟排便的症状，持续时间至少1个月，发病年龄大于4岁[1- 3]。据报道大便失禁的发病率为0.4%～24%不等，并且随着年龄的增加，大便失禁的发病率有明显上升趋势[4]。分娩、外科手术等原因都可引起大便失禁[5]。大便失禁不仅会导致患者生活质量下降，同时常伴有心理问题的发生和社会负担加重[6- 7]。目前的治疗方案包括保守治疗和手术治疗，生物反馈、饮食调节、粪便收集等都是常见的保守治疗方法[8]。手术治疗常用于保守治疗无效及肌肉缺损较大的大便失禁。但目前的疗效仍不理想，尤其是长期疗效和对肛门内括约肌的修复不佳[9-11]。近年来，随着干细胞及再生医学的发展，大便失禁的细胞疗法广泛开展，并在动物模型和临床研究中证实其在大便失禁的修复中发挥积极作用。

1 大便失禁的动物模型及损伤机制

1.1 肛门括约肌损伤模型

目前，大部分研究者构建大便失禁的动物种属为大鼠[4]，也有研究选择兔[12- 13]、狗[14- 15]等。主要动物模型包括以下类型：(1)肛门括约肌切开及修复模型[16]：在肛门括约肌复合体上做一7 mm切口，该切口延伸至肛门外括约肌的上缘，纵向长度约为3～4 mm。然后缝合直肠黏膜(间隔1 mm)，第二层采用单纯间断缝合(间隔 1 mm)作为加固层，最外侧的肛门外括约肌也需要重新缝合。(2)肛门括约肌复合体25%切除模型[17]：切除腹侧25%的肛门括约肌复合体，即10点位到2点位之间的全部括约肌，但文献中未说明切除的具体长度、体积。(3)50%肛门括约肌复合体切除模型[18]：暴露肛门括约肌复合体，切除括约肌大小为1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，重量为0.5 g。(4)低温损伤模型[19]：使用液氮冷冻的3 mm直径铝棒(单次应用30 s)，对肛门括约肌进行冷冻损伤，范围为90°扇形区域，24小时内间隔2次进行。(5)阴部神经挤压模型[20]：采用骶尾部的后侧切口入路，在肛门直肠窝处分离出双侧的阴部神经，用Castroviejo针架压迫2次，每次30 s。其他损伤模型还包括肛门括约肌切开术(sphinctero-tomy，SP)[21- 22]、肛门外括约肌全切术[23]、阴部神经横断术[24]等。但是在损伤模型的相关研究中缺乏具体造模步骤或切除括约肌的体积。对于手术部位也存在多种选择，例如50%肛门括约肌复合体切除模型的损伤区域在左侧[25]、腹侧中部[18]等部位均有文献报道。

模型的正确选择与构建对研究干细胞疗法的效果至关重要 ，在不同括约肌损伤程度(肛门括约肌切开、25%括约肌切除、50%括约肌切除)，不同的损伤类型(括约肌外科损伤、冷冻损伤、神经损伤)以及急性、慢性损伤等大便失禁模型中，干细胞疗法显示出令人鼓舞的效果，未来如果能在众多模型中找到最适合的大便失禁模型，并建立标准建模方法，将在一定程度上促进干细胞对大便失禁疗效的相关研究，减少各研究间异质性，促进研究向更深层次拓展。

1.2 大便失禁的损伤机制

正常排便取决于肛门、直肠、肛门内括约肌、肛门外括约肌、耻骨直肠肌以及它们的血管和神经之间复杂的感觉和运动的相互作用，当它们中的一个或多个结构的相互作用被破坏，而其他部分不能代偿时就会出现大便失禁[26]。肛门括约肌损伤是大便失禁最常见的病理改变，其中大部分是由于产科疾病导致(30%～40%)，孕妇在分娩时会阴部的撕裂、牵拉、缺血以及会阴切开术等可能导致括约肌损伤[4]。此外，肛肠外科手术也可导致括约肌损伤进而引起大便失禁[5]。

2 干细胞的来源和修复机制

2.1 干细胞来源

在大便失禁的研究中使用的干细胞物种来源广泛，包括大鼠、兔、狗以及人等，其中常见的干细胞类型包括骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)、成肌细胞、脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC)，同时神经干细胞、骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells， MNC )等也有研究报道[6]。骨髓间充质干细胞在动物实验中通常来源于股骨和胫骨骨髓[27- 29]，剔除股骨周围肌肉和结缔组织，冲洗骨髓腔培养纯化后获取，而骨髓干细胞在临床研究中尚未开展。成肌细胞在动物实验中的来源包括腓肠肌[19, 30]、后肢[14, 31- 34]等肌肉丰富部位，在临床研究中主要来源于胸大肌[10]。采集脂肪组织进行脂肪干细胞原代提取时，采集部位主要集中于腹部和腹股沟皮下，也有研究者在臂部、内脏和大网膜等部位采集脂肪[25, 35- 39]。神经干细胞通常来源于肠道神经元[40]，骨髓单核细胞来源于骨髓组织[16]。

2.2 干细胞的修复机制

干细胞疗法治疗大便失禁的机制仍不清楚，其多向分化潜能、免疫调节、分泌功能、促进血管生成等特性或许在治疗中发挥着重要作用[41]。干细胞具有很大潜力的分化能力主要是通过体外实验验证的，在体内实验鲜有文献报道，但在Bisson等人[19]的研究中发现注射后的成肌细胞可在体内转化为成熟肌纤维[19]。同时干细胞可以通过多种途径参与免疫反应，例如MSC可以通过旁分泌、细胞-细胞间接触、细胞外囊泡调节免疫反应[42- 43]。干细胞还可以发挥旁分泌作用刺激邻近组织细胞，Nakamura等人[44]发现MSC可以分泌外泌体通过促进肌肉和血管生成促进肌肉再生，这少部分由miRNAs，例如miR- 494介导。

3 临床前研究

目前大便失禁的干细胞疗法相关研究日益增多，且向着更加深入和完善方向发展，但是正如Gras[45]所说，不同干细胞疗法之间缺乏共识。成肌细胞、骨髓间充质干细胞常被选择用于相关研究，脂肪间充质干细胞由于其来源广泛、免疫原性差，近年来的研究也不断增多[12, 25, 37]。

常见的干细胞治疗注射方式包括局部肌肉注射和静脉注射，研究表明两种治疗方式对大便失禁都有积极作用，但在不同研究中二者疗效仍存在较大差异。Sujatha等人[28]的研究表明直接注射而不是静脉注射间充质干细胞可改善损伤后括约肌的收缩功能，并增加了转化生长因子-1和赖氨酸氧化酶的表达，促进肛门外括约肌的基质沉积。Salcedo等人[20]的结果却与上述的研究相反，即静脉注射组和局部注射组可以明显改善肛门括约肌静息压和肌电图(electromyography，EMG)频率，但是局部注射组相比静脉注射组未能改善肛压峰值以及EMG幅度，这表明静脉注射的疗效可能要优于局部注射组。最近Li等人[46]的研究与上述研究的结论都不相同，作者发现局部注射组与静脉注射组在改善肛压基础值方面没有明显差异，但是局部注射组相比于静脉注射组明显改善了肛压峰值、EMG频率、振幅，Massion染色结果也表明局部注射组在伤口部位有更多的新生肌肉。Salcedo等人的研究[20，47]结果表明，静脉注射组和肌肉注射组均可以促进括约肌功能恢复，而且静脉注射组的疤痕组织比肌肉注射更少，但是肌肉注射或许是更可取的方法，因为其需要的细胞量更少。虽然两种注射方式对大便失禁的疗效优劣尚存在争议，但大部分已发表文献表明局部注射组可能优于静脉注射组，这可能是不同研究间造模方式、动物种属、细胞量、细胞制备方法等多因素导致的。

干细胞疗法在促进损伤肛门括约肌功能恢复中表现出可观的疗效，但是由于干预措施、治疗周期等的不同，实验结果存在较多分歧，如能否促进神经损伤的修复。Lane等人[48]通过肛门会阴切开术造模，在成肌细胞治疗2周后，肌电图频率、振幅等方面与对照组相比有明显改善，治疗4周后，各组均恢复至基线水平，无明显差异。Salcedo等人[20]使用SP模型模拟外阴切开术，阴部神经压迫模型模拟分娩导致的神经损伤，间充质干细胞治疗后，SP模型的肛门压力及肌电图得到明显改善，而阴部神经压迫模型没有改善，我们猜测造模方式可能影响神经修复效果。Li等人[46]的研究表明，在MSC治疗后7天、14天以及28天，静脉注射组的肌电图振幅和频率与假手术组没有明显差异，但是局部注射组肌电图振幅及频率出现明显改善，这表明注射方式的不同也可影响神经修复。Oh等人[15]通过切除狗的25%肛门括约肌构建大便失禁模型，并使用自体肌细胞进行治疗，肛压及肌电图结果显示能改善肛门括约肌功能。肌电图是评价损伤后神经及其支配肌肉修复情况的重要指标，许多研究中对于干细胞能否促进损伤后肌电图振幅及频率等的恢复仍不一致，这种差异的原因是多方面的，例如造模方式、干细胞种类、治疗时间、注射方式等，由于神经支配在肌肉收缩中的重要作用，探究干细胞疗法对神经修复的作用是有必要的。

干细胞种类丰富，不同干细胞有其独特的优势和作用机制，例如脂肪干细胞来源广泛，成肌细胞可向肌纤维分化。比较不同干细胞对大便失禁的疗效对选择最佳干细胞类型和指导临床应用具有重要价值。Mazzanti等人[16]比较了骨髓单核细胞和骨髓间充质干细胞的疗效，相比生理盐水组，干细胞治疗组明显改善了肌肉再生，并提高了SR后肛门括约肌的收缩能力。两种骨髓干细胞类型之间没有显著差异，即MNC与MSC在修复肛门括约肌损伤方面同样有效。本团队最近的研究比较了局部注射MSC、ADSC和基质血管组分(cellular stromal vascular fraction，CSVF)对大便失禁的疗效，结果显示治疗后第5天CSVF组的肌电图振幅和频率明显高于PBS组，而MSC组和ADSC组却没有明显增高。第10天时MSC、ADSC、CSVF组的肛压和肌电图明显改善，并且新生组织中肌肉比例明显高于PBS组，三者之间没有统计学差异，即三者对大便失禁的修复效果相同(虽然第10天ADSC和MSC组的肛压基础值和肌电图频率趋势上高于CSVF组，但没有统计学差异)。不同干细胞类型间疗效比较的研究较少，尤其是成肌细胞、神经干细胞等细胞之间的比较尚缺乏，并且已发表文献仅为临床前研究证据，缺乏临床研究证据探索不同干细胞间疗效优劣。

4 临床研究

近年来干细胞治疗肛门括约肌失禁的临床研究也显示出令人鼓舞的结果。 Boyer 等人[49]的一项研究共纳入24名大便失禁的患者，患者接受自体成肌细胞(autologous myoblast，AM)或安慰剂治疗后，中位克利夫兰失禁(Cleveland Clinic Incontinence，CCI)评分在治疗6个月后与基础值相比有明显下降，12月后，AM治疗组的中位CCI评分与对照组相比明显下降，并且反应率明显高于对照组。Frudinger的研究[50]将自体成肌细胞注射到EAS损伤区域，治疗后1个月和6个月，肛门压力明显上升，12月后Wexner失禁评分下降，粪便失禁生活评分(faecal incontinence quality of life, FIQL)明显改善。随后2015年Frudinger等人[51]为观察成肌细胞治疗后的长期治疗效果又纳入10名妇女[51]，纳入标准与之前的研究相同，结果显示随着时间延长Wexner失禁评分持续改善，排便频率减少，肛门静息压和收缩压持续改善，并且生活质量总体提高。2018年Frudinger等人[10]又探究了在更大目标人群中成肌细胞的治疗效果，结果表明扩大目标人群后成肌细胞仍然具有明显效果，每周大便失禁次数、FIQL评分明显改善，Wexner失禁评分和大便失禁严重程度明显下降。 Sarveazad等人[39]的研究表明ADSC对大便失禁患者的治疗效果不理想，所有患者在实施括约肌成形术后，实验组和对照组分别给予ADSC和PBS治疗，2个月后实验组与对照组的Wexner评分增加值没有显著差异，然而ADSC治疗组的EMG和病变区的肌肉比例明显增加。de la Portilla等人[38]也对ADSC治疗大便失禁的疗效进行探索，结果表明这种治疗是安全的，但未能证明能改善患者的情况。成肌细胞不仅在短期内有明显效果，在更长时间和更大目标人群中也明显改善了大便失禁患者的生活质量，然而两项脂肪干细胞治疗大便失禁的临床研究却未表现出明显优势，还需要进一步探索。

5 结论与展望

大便失禁的动物模型种类多样，可模拟不同因素导致的大便失禁，同时可选择的干细胞类型丰富，临床前研究中最常使用的干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、成肌细胞。但是在临床研究中成肌细胞和脂肪干细胞更为常见，骨髓干细胞尚未用于临床研究。但对于干细胞治疗大便失禁的具体机制不清，不同研究间干细胞来源、制备方法、造模方式等缺乏规范化管理。

大量研究表明，细胞疗法在治疗大便失禁方面具有很大潜能，能明显提高患者预后，促进肛门括约肌功能恢复。虽然临床研究仍较少，未来需要更大样本、更加深入的研究探索，但细胞疗法的似乎是安全、可耐受的。