乳酸乳球菌Z-2 不同处理方式对鲤益生作用的离体研究

■蔡忠良 张静静 王淏冉 任欣欣 朱超杰 刘莎莎 崔文姗 冯军厂

（河南师范大学水产学院，河南 省水产动物养殖工程技术研究中心，水产动物疾病控制河南省工程实验室，河南 新乡 453007）

随着水产养殖业的发展，集约化、工厂化、高密度养殖已成为行业的发展趋势。在该类养殖模式下，养殖面积急剧扩张；水体污染日益严重；抗生素的滥用导致耐药菌株不断出现、鱼病更加难以治疗；同时抗生素残留也危害了食用者的安全。益生菌是一种活性微生物，足够数量的益生菌可以提供给宿主有益的作用，包括改善宿主肠道微生物环境、消化酶活性、非特异性免疫，促进动物生长和增强机体对病原体的抵抗力等。乳酸菌作为最常见的益生菌，通常分离于健康动物或其生活环境，因此他们被认为是绿色的、环境友好的和安全的，这使得他们成为抗生素的潜在替代物。在水产养殖中，对乳酸菌的研究主要是将其作为微生态制剂添加到饲料中，探究其对宿主生长性能、免疫应答和抗氧化活性的影响。

目前，阻碍乳酸菌作为饲料添加剂的挑战之一是其存活率问题。由于活菌的不稳定性，研究者们将热灭活菌株、胞外多糖和菌株细胞壁成分等多种处理方式应用到微生态制剂之中。如将含2×1011CFU/g灭活后的植物乳杆菌L-137（Lactobacillus plantarumL-137）菌粉，以20～50 mg/L喷洒在日粮之中可以增强尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的免疫力和抗病能力；给黄羽肉鸡雏鸡口服热灭活草分枝杆菌（Myco⁃bacterium phlei），能够显著提升鸡的细胞免疫应答以及血清、小肠黏液的IgA分泌量，并促进鸡的生长；热灭活后的乳双歧杆菌BL-99（BifidobacteriumBL-99）不仅可以缓解小鼠结肠炎，还可以调节机体免疫和肠道菌群；此外Giahi等（2013）还发现，热灭活菌株和活菌一样，诱导细胞因子分泌的能力和菌的剂量有关，并具有菌种和菌株特异性。本试验室前期的研究表明，乳酸乳球菌Q-9（Lactococcus lactisQ-9）所产生的胞外多糖（exopolysaccharides of cell-free culture superna⁃tant, EPS），在鲤（Cyprinus carpioL.）体内和体外均具备提高其非特异性免疫、抗氧化活性和抗病原菌感染的能力；注射柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）EPS后，可以增加草鱼（Ctenopharyngodon idellus）免疫相关基因表达量，增强免疫功能并加强机体的炎症反应和抗原提呈能力以及草鱼对柱状黄杆菌的抵抗力，提高草鱼的免疫应答水平。副干酪乳杆菌D3-5（Lac⁃tobacillus paracaseiD3-5）细胞壁的脂磷壁酸改善了老龄小鼠（>79周）的肠道炎症和其认知功能，还可以延长秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的寿命。同时，日粮中添加2.0%粉末状植物乳酸杆菌提取物，可以提高猪的生长性能、免疫机能及经济效益。以上研究结果表明：热灭活的益生菌、益生菌的胞外多糖、细胞成分以及提取物，仍可继续发挥益生作用。

乳酸乳球菌Z-2（Lactococcus lactisZ-2）及其胞外多糖可增强鲤免疫反应和抗病的能力。但L. lactisZ-2的热灭活或其他处理方式是否仍对鲤表现出益生作用，值得进一步研究。因此，试验设置6种处理方式：活菌及上清液的混合物（mixture of live cells and su⁃pernatant, LCS）、无细菌培养上清液（cell-free culture supernatant, CS）、活菌（live cells, LC）、菌热灭活（heat-killed cells, HK）、菌超声破碎（ultrasonic bro⁃ken of cells, UB）和EPS-2 与鲤头肾单核细胞体外共培养，通过相关指标检测，探究鱼源L. lactisZ-2菌株的不同处理方式对鲤的益生作用，以期为合理使用潜在的益生菌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验菌株

L. lactisZ-2 从健康鲤的肠道内容物中分离获得，根据其理化特性和16S rDNA序列分析，鉴定为乳酸乳球菌。

1.2 L. lactis Z-2的不同处理

LCS：活菌及上清液的混合物，将L. LactisZ-2在无菌MRS培养基中37 ℃静置培养24 h（5×108个/mL，下同）；CS：无细菌培养上清液，L. LactisZ-2培养24 h后离心（8 000 r/min，5 min，4 ℃）收集上清液；LC：活菌，L. LactisZ-2培养24 h后离心（8 000 r/min，5 min，4 ℃）收集菌株，无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3 次后重悬浮于同体积PBS 中；HK：热灭活，按照同样方法获得LC 溶液，该溶液再经100 ℃热处理10 min；UB：超声破碎，将同样方法获得的LC 溶液经超声处理（破碎3 s，暂停3 s，功率40%，破碎时间10 min）；EPS-2（1 000 μg/mL）：L. LactisZ-2胞外多糖，具体处理方法参照先前研究。

1.3 鲤头肾细胞的分离与处理

将健康鲤[体重（47.66±0.43）g]麻醉后，于无菌条件下取出头肾并分离其巨噬细胞/单核细胞。加入RPMI-1640培养基[10%胎牛血清（GIBCO，USA）、100 μg/mL链霉素和100 U/mL 青霉素（Sigma，USA）]，调整细胞浓度后加入24 孔细胞培养板（2×106个/mL）。然后将经不同处理方式的L. LactisZ-2（上述6种处理）作为试验组加入细胞培养板，100 μL/孔，以PBS作为对照组，于28 ℃细胞培养箱共培养24 h后，检测孵育液中的细胞因子和一氧化氮（NO）合成量。

1.4 鲤头肾细胞增殖能力的检测

为探讨L. LactisZ-2 不同处理对鲤头肾细胞增殖能力的影响，使用不同处理方式的L. LactisZ-2 与头肾细胞（2×106个/mL）28 ℃孵育20 h 后，每孔加入50 μL的四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂（5 mg/mL），进一步孵育4 h，弃掉上清液后加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），使用EnSpire 2300酶标仪（PE EnSpire，USA）在570 nm处测量吸光值。

1.5 鲤头肾细胞吞噬活性的检测

为探究L. LactisZ-2不同处理对鲤头肾细胞吞噬活性的影响，方法与上述相似，不同处理方式的L.LactisZ-2与头肾细胞28 ℃孵育20 h后丢弃上清液，每孔加入300 μL中性红色染料（0.1%），继续孵育4 h后弃去上清液，PBS 洗涤3 次以去除多余的中性红色染料。然后向每个孔中加入100 μL细胞裂解缓冲液（等体积混匀的乙醇和冰醋酸），并将平板再次孵育2 h以提取吞噬的中性红色染料，最后用EnSpire 2300酶标仪（PE EnSpire，USA）在540 nm处测量吸光度。

1.6 一氧化氮（NO）的检测

根据总一氧化氮（NO）试剂盒说明书（Beyotime，上海，中国）测定头肾细胞孵育液中NO的含量。使用EnSpire 2300 酶标仪（PE EnSpire，USA）在490 nm 处测量吸光度，并依据亚硝酸钠5倍稀释制备的标准曲线估算孵育液中NO的浓度。

1.7 相关免疫指标的检测

为评估L. LactisZ-2 不同处理的免疫调节活性，使用本实验室制备的多克隆抗体通过ELISA 方法进行检测。简而言之，将培养上清液与2×包被缓冲液（0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6）等体积混匀后加入96 孔免疫印迹板（Nunc）于4 ℃下包被过夜，然后加入10%脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h，洗涤后加入相应细胞因子的多克隆抗体（1：1 000），其余的试验步骤参照之前的相关研究。

1.8 数据分析

试验数据使用one-way ANOVA和Duncan’s多重比较（SPSS 25 软件）进行数据检验，设置P<0.05 为差异显著水平，并采用柱状图以“平均值±标准差（Mean±SD）”的形式呈现。

2 结果与分析

2.1 L. lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞增殖能力的影响（见图1）

图1 L.lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞增殖能力的影响

如图1所示，CS和HK同对照组相比，对头肾细胞增殖能力无显著促进作用（P>0.05）；LCS、LC、UB 和EPS-2 组鲤头肾细胞的增殖能力均显著高于对照组（P<0.05）。LC（1.580±0.032）对鲤头肾细胞的增殖能力具有最积极的促进作用，且同其余各组相比都具有显著性的提升（P<0.05）。

2.2 L. lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞吞噬活性的影响（见图2）

图2 L.lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞吞噬活性的影响

如图2 所示，CS 同对照组（1.00±0.082）相比无显著促进作用（P>0.05）；LCS、LC、HK、UB 和EPS-2 对鲤头肾细胞吞噬活性均显著高于对照组（P<0.05）。LCS（1.520±0.058）对鲤头肾细胞的吞噬活性具有最积极的影响作用，且同其余各组相比都具有显著性的提升（P<0.05）。

2.3 L. lactis Z-2 不同处理对鲤头肾细胞NO 含量的影响（见图3）

图3 L. lactis Z-2不同处理对诱导鲤头肾细胞产生一氧化氮（NO）的影响

如图3所示，CS同对照组[（1.28±0.057）μmol/L]相比无显著促进作用（P>0.05）；LCS、LC、HK、UB和EPS-2孵育液中NO 的浓度均显著高于对照组（P<0.05），EPS-2[（1.960±0.043）μmol/L]孵育液中的NO含量最高。

2.4 L. lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞促炎细胞因子的影响（见图4）

图4 L.lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞分泌促炎细胞因子的影响

如图4所示，在促炎细胞因子（TNF-α、IL-β、IL-6）中，每个处理组相对于对照组都得到了显著的促进作用（P<0.05），较之对照组[（6.99±0.52）pg/mL]对促进TNF-α释放最佳的处理组是LCS[（23.11±1.31）pg/mL]（P<0.05）；较之对照组[（526.16±65.18）pg/mL]促进IL-β释放最佳的处理组是HK[（991.82±55.86）pg/mL]，且同其余各组相比都具有显著性的提升（P<0.05）；较之对照组[（82.65±5.59）pg/mL]对促进IL-6释放最佳的处理组是LCS[（147.98±8.25）pg/mL]和CS[（147.38±7.94）pg/mL]，且同其余各组相比都具有显著性的提升（P<0.05）。

2.5 L. lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞抗炎细胞因子的影响（见图5）

图5 L.lactis Z-2不同处理对鲤头肾细胞分泌抗炎细胞因子的影响

如图5所示，在抗炎细胞因子（IL-10、TGF-β）中。较之对照组[（50.38±2.99）pg/mL]，LCS、CS 和EPS-2对抗炎细胞因子IL-10 有显著的促进作用（P<0.05），且LCS[（81.82±3.03）pg/mL]具有最佳的促进作用；对于抗炎因子TGF-β而言，每个处理组相对于对照组[（91.90±8.68）pg/mL]均有显著的促进作用（P<0.05），且同样是LCS[（139.56±9.69）pg/mL]具有最佳的促进作用。

3 讨论

头肾是鱼体重要的免疫器官，作用和功能类似哺乳动物的淋巴，其中含有大量的免疫细胞（淋巴细胞、巨噬细胞等），这构成了鱼体固有免疫系统的第一道防线，在抵抗病原体和病菌入侵方面发挥着重要作用。所以此类细胞的增殖能力和吞噬活性是其最重要的两种功能。本试验中，L. lactisZ-2 的LCS、LC、UB 和EPS-2对鲤头肾细胞的增殖能力显著高于对照组（P<0.05）；LCS、LC、HK、UB和EPS-2处理对鲤头肾细胞吞噬活性的影响均显著高于对照组（P<0.05）。LCS对头肾细胞的吞噬活性具有最积极的影响作用，LC对鲤头肾细胞具有最佳的细胞增殖促进效果。这与添加L.lactisZ-2投喂鲤，提升鲤免疫能力及添加类红球细菌WL-APD911（Rhodobacter sphaeroidesWL-APD911）投喂奥尼罗非鱼（Oreochromis mossambicus×Oreochromis niloticus）提升奥尼罗非鱼免疫能力结果类似。

巨噬细胞可以释放免疫因子（NO、IL-1β、TNF-α等），在宿主防御病原体和其他浸润细胞中发挥着重要作用。其活性同头肾细胞吞噬活性呈正相关，所以提升头肾细胞的吞噬活性便会提升头肾细胞的呼吸爆发活性，进而增强固有免疫机能。NO 可与头肾吞噬细胞呼吸爆发产生的超氧阴离子发生反应，抑制或杀死病原菌，因此NO 是机体免疫体系中的一个关键细胞防御因子，其能启动机体的免疫系统，是调节机体炎症的介质。在之前的研究中，我们发现使用不同浓度的L. lactisQ-9 胞外多糖可诱导鲤高水平NO 的生成，并能相应减少由嗜水气单胞菌引起的NO 合成量。本试验中，LCS、LC、HK、UB 和EPS-2 孵育液中NO 的浓度显著高于对照组（P<0.05），EPS-2 对鲤头肾细胞孵育液中NO含量的增加具有最佳的效果。这与使用EPS-2灌胃处理提升鲤免疫能力、通过注射柱状黄杆菌胞外多糖提升草鱼免疫活性及使用复合植物多糖提升兔的免疫机能结果类似。

白介素、肿瘤坏死因子等作为介导细胞免疫的主要细胞因子，具有调节免疫应答、参与炎症反应等生物学功能，且根据在炎症反应中所发挥的作用效果，细胞因子可以分为促炎性和抗炎性2 类细胞因子，IL-6、IL-1β和TNF-α属于促炎性细胞因子，IL-10、TGF-β属于抗炎性细胞因子，二者含量的变化可作为评价免疫机能的重要指标。在本试验中，对TNF-α释放最佳的处理组是LCS；对IL-β释放最佳的处理组是HK；对IL-6释放最佳的处理组是LCS 和CS。在抗炎因子之中，LCS、CS和EPS-2对抗炎细胞因子IL-10有显著的促进作用（P<0.05），且LCS具有最佳的促进作用；相对于对照组，L. lactisZ-2的每个处理组对抗炎因子TGF-β均有显著的促进作用（P<0.05），且LCS具有最佳的促进作用。

这些结果同先前讨论的活菌、热灭活益生菌、胞外多糖、细胞成分等提升机体免疫能力的试验结果类似。本试验所设计的6种益生菌处理方式，均可在不同程度、不同方面提升免疫器官（头肾）的免疫表达，但各处理组对于每个检测指标的提升能力却不同，每种处理方式对鲤所产生的益生作用，还需进一步深入研究。

4 结论与展望

①鱼源L. lactisZ-2 的不同处理方式（LCS、CS、LC、HK、UB和EPS-2）均可对鲤头肾细胞产生不同程度的免疫促进作用，综合各项指标，效果最显著的是LCS。

②鱼源L. lactisZ-2 的不同处理方式可作为益生菌的多种形式在水产养殖中应用。如将活菌及上清液的混合物（LCS）、活菌（LC）加进轮虫或卤虫培养体系中；将无细菌培养上清液（CS）和超声破碎（UB）喷洒到饲料上；将热灭活（HK）的细菌制成菌粉，在饲料制作过程中添加；胞外多糖（EPS-2）可灌胃、注射或制成胶囊等。

③鱼源L. lactisZ-2 不同处理对鲤具有显著的离体免疫调节作用，不同处理方式也为合理利用潜在的益生菌提供理论依据，为益生菌的使用提供新的解决方法。