饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能、免疫器官指数及肠道菌群的影响

■白勇昌 肖明霞 赵 平 陈德近 程志斌*

（1.云南农业大学，云南 昆明 650201；2.爱科特生物工程（昆明）有限公司，云南 昆明 650506）

我国农业农村部2020 年7 月1 日始禁止促生长类药物饲料添加剂的使用，包括益生菌凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）在内的替抗功能性添加剂成为行业应用的热点（葛长荣等，2019；王乙茹等，2019a；夏涛等，2019a；柳成东等，2020）。目前，大量饲养试验表明凝结芽孢杆菌能够显著改善1～42 日龄AA 肉鸡生长性能（Hung等，2012；林丽花等，2014；曹广军等，2016；孙焕林等，2014；赵娜等，2017；王乙茹等，2019a；夏涛等，2019a；严涛等，2019）；然而也有少量报道发现，21～42 日龄阶段肉鸡应用凝结芽孢杆菌对生长性能没有明显的改善作用（宫秀燕等，2015a；宫秀燕等，2015b；Wu 等，2018；Zhen 等，2018；Li 等，2019）。以上饲养试验矛盾的结果提示：除试验阶段因素外，试验用凝结芽孢杆菌及其抑菌性能的不同，可能是肉鸡生长性能表现差异的关键原因之一（夏涛等，2018；夏涛等，2019b；柳成东等，2021）。张韵等（2017）采用体外抑菌试验表明，其筛选的4株凝结芽孢杆菌（菌株编号：BC147、BC235、BC310、BC303）对大肠杆菌、鸡肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等肠道有害菌的抑制作用差异显著。鉴于以往所有的试验报道，只是单一通过饲养试验评估凝结芽孢杆菌的应用效果，没有同时开展凝结芽孢杆菌的体外抑菌试验研究。因此，文章首次结合饲养试验和体外抑菌试验，重点评估21～42日龄阶段肉鸡饲粮添加凝结芽孢杆菌对生长性能、免疫器官及肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用凝结芽孢杆菌（菌株编号：YNAU 5517）及制剂由云南农业大学提供（王乙茹等, 2019b；王乙茹等，2020）。体外抑菌试验所用材料，包括指示菌大肠杆菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）及罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、金霉素和土霉素，均由昆明三正生物科技（集团）有限公司提供。

1.2 试验设计

按体重一致原则将160 只21 日龄健康AA 肉公鸡分为2个处理组。每个处理组10个重复，每个重复（单笼）8只鸡。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮基础上添加凝结芽孢杆菌，添加量4×106CFU/g全价配合饲料（王乙茹等，2019b）。

1.3 试验饲粮

参考《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）并结合云南省AA 肉鸡实际养殖特点配制试验日粮，基础日粮组成及营养水平见表1，不添加抗生素、其他饲用益生菌及功能性替抗添加剂。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.4 饲养管理

试验在云南农业大学试验鸡场进行。试验鸡全程笼养，24 h光照，自由采食与饮水，执行正常免疫程序。及时进行清粪与消毒，保证鸡舍良好的卫生环境，实时观察鸡群健康情况，及时进行记录和治疗。试验周期是肉鸡21～42日龄。

1.5 测定指标

1.5.1 生长性能以重复为单位统计肉鸡平均日增重、平均日采食量及料重比（王乙茹等，2020）。

1.5.2 免疫器官指数

至肉鸡42 日龄，每笼随机挑选1 只肉鸡屠宰，取脾脏、胸腺、法氏囊称重。免疫器官指数为该器官重量除以活体重的百分数（Zhang等，2019）。

1.5.3 肠道菌群测定

取盲肠食糜于EP 管内，液氮速冻后转至-80 ℃冰箱保存，用于大肠杆菌和乳酸杆菌数量检测。采用平板计数法检测大肠杆菌和乳酸杆菌数量，检测结果用log值表达（黄遵锡等，2020）。

1.5.4 凝结芽孢杆菌抑菌作用的体外试验评估

以金霉素（Ⅰ组）、土霉素（Ⅱ组）为参照，采用牛津杯法测定抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ），对比评估本试验所用凝结芽孢杆菌（Ⅲ组）对大肠杆菌K88、罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用。参照李静舒等（2020）报道，依据本试验所用牛津杯的直径值（7.8 mm），将牛津杯外径约2 倍值（16.0 mm）作为区分敏感与高敏感的判定标准，因此抑菌作用的判定标准如下：不敏感，DIZ=7.8 mm；敏感，7.8 mm16.0 mm。

1.6 数据统计

生长性能、免疫器官指数、肠道菌群等数据采用T-test统计，DIZ数据采用单因素方差分析和Duncan’s多重比较。采用SPSS 17.0 统计软件，P<0.05 表示显著差异，0.05

2 结果与分析

2.1 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响（见表2）

表2 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响

由表2 可知，与对照组比，试验组肉鸡的料重比显著降低（P<0.05）。此外，试验组和对照组之间的42 d 体重、平均日增重及平均日采食量差异不显著（P>0.05）。

2.2 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响（见表3）

由表3 可知，与对照组比，试验组肉鸡法氏囊指数显著增加（P<0.05），脾脏指数有增加的趋势（0.050.05）。

表3 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响

2.3 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道菌群的影响（见表4）

表4 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡盲肠食糜菌群的影响（log10 CFU/g）

由表4可知，与对照组比，试验组肉鸡盲肠食糜中大肠杆菌数量显著降低（P<0.05），乳酸杆菌与大肠杆菌的比值显著提高（P<0.05）。此外，试验组和对照组之间盲肠食糜的乳酸杆菌数量差异不显著（P>0.05）。

2.4 凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88、罗伊氏乳酸杆菌的体外抑制作用（见图1和表5）

图1 凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88（A）、罗伊氏乳酸杆菌（B）的体外抑制作用

表5 凝结芽孢杆菌与金霉素、土霉素对大肠杆菌K88、罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用[抑菌圈直径（DIZ），mm]

由图1 和表5 可知，凝结芽孢杆菌对肠道有害菌大肠杆菌K88 的抑制作用为敏感（7.8 mm16.00 mm），抑菌效果均显著高于凝结芽孢杆菌（P<0.05）。

3 讨论

3.1 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响

本研究开展的肉鸡21～42日龄饲养阶段，与对照组饲喂基础饲粮的肉鸡比，饲喂凝结芽孢杆菌的试验组肉鸡料重比显著降低4.52%；此外，两组之间平均日采食量、平均日增重差异不显著，且试验全程无肉鸡死亡。Hung等（2012）最早报道，21～42日龄肉鸡饲粮添加凝结芽孢杆菌显著降低了料重比，且对平均日采食量和平均日增重无显著影响。王政等（2016）通过饮水添加凝结芽孢杆菌的试验显示：与对照组比，凝结芽孢杆菌显著降低了21～42日龄肉鸡的料重比，且平均日采食量和平均日增重也无显著影响。均与本试验结果基本一致，均证明：在卫生状况良好的养殖条件下，21～42 日龄肉鸡应用凝结芽孢杆菌有助于生长性能的改善，具体表现在良好的饲料转化效率。

3.2 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响

胸腺、脾脏和法氏囊是肉鸡主要的免疫器官（宫秀燕等，2015b；夏涛等，2019a），免疫器官指数反映了肉鸡免疫器官的发育程度，免疫器官发育良好能够为肉鸡提供正常的免疫保护，有助于保障肉鸡良好的生长性能（Al-Khalaifa等，2019；王乙茹等，2019a）。表3结果显示：与对照组相比，试验组肉鸡法氏囊指数显著增加11.54%；脾脏指数增加5.04%，有统计差异的趋势；此外，两组之间胸腺指数差异不显著。以上结果表明，饲粮添加凝结芽孢杆菌有助于肉鸡免疫器官的发育，尤其是法氏囊和脾脏的发育完善对肉鸡良好生长性能有积极的意义。赵娜等（2017）研究显示，与对照组相比，饲喂0.3×106CFU/g（全价配合饲料）凝结芽孢杆菌组AA肉鸡脾脏指数显著增加40.00%；法氏囊指数增加了25.00%，有增加的趋势，与本试验结果基本相符。严涛等（2019）研究表明：与对照组相比，0.3×106CFU/g凝结芽孢杆菌组AA肉鸡的法氏囊指数和脾脏指数分别增加了47.65%、18.96%，但两组之间统计差异不显著。对比严涛等（2019）报道与本试验结果之间的差异，原因可能包括：①凝结芽孢杆菌的添加量不同。本试验凝结芽孢杆菌的添加量高于严涛等（2019）的报道。②试验设计不同。本试验是2组数据的统计分析，然而严涛等（2019）设计4个处理组的统计分析。③组内数据变异系数的差异。本试验2 个处理组免疫器官指数数据的组内变异系数在6.9%以下，然而严涛等（2019）报道的4个处理组免疫器官指数数据的组内变异系数整体偏高，最大值达30.5%，这可能是严涛等（2019）报道试验组肉鸡法氏囊和脾脏指数增加47.65%和18.96%，但与对照组差异不显著的关键原因。

3.3 饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道菌群的作用及机制

肠道菌群平衡是肉鸡肠道健康及良好生长性能的重要保障（Clavijo 等，2018；Shang 等，2018）。大肠杆菌是影响肉鸡健康及生长性能的肠道主要有害菌，乳酸杆菌是肉鸡肠道的优势有益菌，二者数量及比例对肉鸡肠道菌群平衡、生长性能发挥具有重要意义（Clavijo 等，2018；Shang 等，2018）。表4 结果显示：与对照组比，试验组肉鸡盲肠食糜大肠杆菌数量显著降低14.03%；乳酸杆菌数量虽增加了0.73%，但无显著差异。赵娜等（2017）研究显示，饲用凝结芽孢杆菌显著降低42 日龄AA 肉鸡盲肠食糜大肠杆菌数量；且Wu等（2018）报道，饲粮添加凝结芽孢杆菌对42日龄AA肉鸡盲肠食糜的乳酸杆菌数量无显著影响。以上报道与本试验结果一致。进一步分析表4结果：与对照组比，试验组肉鸡盲肠食糜中乳酸杆菌与大肠杆菌的比值显著升高。这一结果提示，凝结芽孢杆菌具有优化肠道菌群的作用，其机制可能与试验用凝结芽孢杆菌的抑菌性能有关。据此，本研究进一步开展了该株凝结芽孢杆菌的体外抑菌试验，以验证其在体内优化盲肠食糜菌群的作用。

牛津杯法是体外试验评估益生菌抑菌性能的主要方法之一（柳成东等，2021）。为了验证饲用凝结芽孢杆菌对试验组肉鸡盲肠食糜大肠杆菌和乳酸杆菌数量的影响，体外抑菌试验对应选用肠道有害菌的代表指示菌产肠毒素大肠杆菌K88 及肠道有益菌的代表指示菌罗伊氏乳酸杆菌，并以金霉素和土霉素为参照，对比评估该株凝结芽孢杆菌的抑菌作用及效果。图1 和表5 显示，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88 的抑制作用达到敏感水平，具有良好的抑制效果。这与张韵等（2017）、汪攀等（2017）、周倩等（2020）的报道一致，从而验证饲喂该株凝结芽孢杆菌抑制盲肠内有害菌大肠杆菌的结果（见表4）。

此外，本研究体外评估了凝结芽孢杆菌对肠道有益菌乳酸杆菌的抑制作用。由于罗伊氏乳酸杆菌是畜禽肠道分布最广泛、比例最高的乳酸杆菌（张如春等，2019），因此体外抑菌结果能够反映饲喂该株凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道乳酸杆菌的影响。图1 直观结果显示：凝结芽孢杆菌（Ⅲ组）对罗伊氏乳酸杆菌无抑制作用（不敏感）；相反，广谱饲用抗生素金霉素（Ⅰ组）及土霉素（Ⅱ组）显著抑制罗伊氏乳酸杆菌（高敏感）。这一结果充分表明：凝结芽孢杆菌的应用避免了以往饲用抗生素对肉鸡肠道有益菌的不利影响，这是凝结芽孢杆菌进一步优化肠道菌群的作用机制，从而实现了无抗养殖条件下肉鸡生长性能的改善。

4 结论

本研究首次结合体内外试验证明：饲粮添加凝结芽孢杆菌能够通过抑制肠道有害菌、优化肠道菌群以及增强免疫器官的发育，实现无抗养殖条件下肉鸡生长性能的改善。在当前我国饲料禁抗的态势下，本研究结果为广大饲料企业评估和选用饲用凝结芽孢杆菌提供了技术参考。