正己酸对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑制效果研究

■胡光辉 林 淼* 王阔鹏 吉慧敏 张建刚，2 封丽梅 蒋 慧

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.中华人民共和国天津海关，天津 300041）

1928 年弗莱明（Fleming）发现了青霉素，抗生素的出现对医学产生了革命性的影响，挽救了无数人的生命，抗生素的发现是人类医学历史的转折点[1]。然而细菌能够发展、获得和传播许多耐药性的问题很快就被发现，每当一种新的抗生素进入市场，具有抗药性的细菌即被发现[2]，而新德里金属β-内酰胺酶阳性肠杆菌科的出现，说明抗生素的抗菌能力正在逐步减弱[3]。中华人民共和国农业农村部公告第194号，自2020年7 月1 日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中草药类除外）的商品饲料，我国具有70多年历史的抗生素饲料添加的时代已经过去，寻求高效、安全的抗生素替代品成为了新的研究热点及任务[4]。有机酸可作为饲料添加剂用于提高畜禽生产性能、改善畜禽产品品质[5]。李成良[6]研究发现有机酸具广谱的抑菌性，在仔猪饲料中添加乳酸，有利于胃肠道的酸化及抑制微生物的生长繁殖。李曼玲[7]认为有机酸是中草药发挥抗菌消炎作用的重要物质。Huang等[8]研究发现口腔细菌产生的脂肪酸，对其本身无特异性活性，但抑制了其他口腔微生物的生长。潘宝海等[9]认为有机酸具有降低饲料pH、调节菌群结构、抑菌杀菌等作用。可见有机酸具有提高畜产品品质、调节肠道微生物结构、抑菌杀菌等特点。正己酸是六碳原子的脂肪酸，常温下为无色油状液体，分子式C6H12O2，分子量116.16，熔点-3 ℃，沸点202 ℃，微溶于水，易溶于有机溶剂。我国准许己酸作为食品用合成香料适量添加于食品中使用[10]。正己酸在替代抗生素的抑菌效果方面有待进一步研究。本试验选取了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，进行了正己酸的体外抗性试验研究，评估其对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制能力，挖掘正己酸在替代抗生素方面的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

药剂与菌种：青霉素、链霉素、庆大霉素均由北京Solarbio 公司提供；正己酸购自上海阿拉丁科技股份有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由扬州大学动物科学与技术学院提供。胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂购自广州辉康生物科技有限公司；NaCl购自国药集团化学试剂有限公司。

LB（Luria-Bertani）液体培养基：酵母提取物1 g/100 mL、NaCl 2 g/100 mL、胰蛋白胨2 g/100 mL。配制固体培养基时加入3 g/100 mL琼脂。

1.2 试验仪器

试验使用的仪器有ULTS1368 冰箱（美国Thermo fisher 公司）、Multiskan Go 酶标仪（美国Thermo fisher公司）、LDZX-50KBS高压灭菌锅（上海中安医疗器械厂）、BSA124S电子天平（德国Sartorius公司）、IS-RSDA恒温振荡器（美国Benchmark公司）、HDL无菌操作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、Centrifuge 5810R台式高速低温离心机（德国Eppendorf 公司）、MC1000离子溅射仪（Hitachi 日本株式会社）、GeminiSEM 300蔡司场发射扫描电镜系统（德国Carl Zeiss公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液的制备

将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌从-80 ℃冰箱中取出，在LB 固体培养基上划线培养，在37 ℃下培养24 h，挑取单菌落于5 mL LB液体培养基中，在37 ℃，170 r/min 恒温摇床活化培养12 h 即制得菌悬液。将菌液浓度稀释成吸光度0.085（菌液浓度108CFU/mL），最终稀释菌液浓度106CFU/mL。

1.3.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

参考鲁萌萌等[11]方法，采用等浓度梯度稀释法测定正己酸对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的MIC，使其最终浓度分别为400、700、1 000、1 300、1 600 μg/mL，在96孔板中加入上述5个浓度梯度的培养液各200 μL，设置3组平行组，向其中各加入大肠杆菌菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液4 μL，以仅加培养基组作为培养基对照组，仅加菌悬液组作为菌液对照组。参考许璐等[12]方法采用二倍稀释法将青霉素、链霉素、庆大霉素稀释为2.5、5、10、20、40 μg/mL，同样设置3组对照组，向其中各加入大肠杆菌菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液4 μL，以仅加培养基组作为培养基对照组，仅加菌悬液组作为菌液对照组。将96孔板放入37 ℃恒温培养箱中培养12 h，用酶标仪测定OD（595 nm）值，试验组吸光度-培养基对照组吸光度≤0.05 的最小正己酸浓度为大肠杆菌/金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度[13-14]。取肉眼可见无菌体生长的孔中的培养液10 μL，涂布于LB固体培养基上，于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，将平板上菌落数≤5个的最低正己酸浓度定为MBC[15]。

1.3.3 微生物生长曲线绘制

将已制备的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液加入1/2MIC 和MIC 的正己酸溶液中，以不加正己酸的LB 液体培养基为空白对照组，在120 r/min、37 ℃的摇床中培养24 h，每小时取样200 μL，加入无菌的96孔板中，在酶标仪下测定其OD值（595 nm）。

1.3.4 牛津杯抑菌试验

参考李静舒等[16]的方法，当抑菌圈的直径（DIZ）>20 mm 时为极敏，16～20 mm 为高敏，12～16 mm 为中敏，7.8～12 mm为低敏，直径<7.8 mm为不敏。吸取大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌悬液50 μL，涂布于LB固体培养基上，将三个牛津杯放于培养基表面，向其中加入150 μL 不同浓度己酸，作为平行组。将培养基放入37 ℃培养箱中培养24 h，测抑菌圈直径。

1.3.5 扫描电镜分析

参考谢家仪等[17]的方法，将已制备的待测菌悬液加入正己酸的MIC 的LB 液体培养基中，以不加正己酸组为对照组，向培养液中加入多聚赖氨酸爬片，在37 ℃恒温培养箱中培养12 h，在4 ℃冰箱中用体积分数为2.5%的戊二醛固定6 h，以不同体积分数乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）依次脱水，并置于-80 ℃冰箱中冷冻保存4～8 h 后，冷冻干燥24 h。最后粘在金属箔上固定并喷金，在扫描电镜下观察细胞形态。

1.4 数据处理

试验数据采用GraphPad Prism 6.0 绘制曲线；采用SPSS 24.0 进行单因素方差（one-way ANOVA）分析，使用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 MIC与MBC的确定（见表1、图1和图2）

由表1、图1 和图2 所示，正己酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均有抑制作用。正己酸对大肠杆菌的MIC 为700 μg/mL，对大肠杆菌的MBC为1 000 μg/mL。正己酸对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为1 000 μg/mL和1 300 μg/mL。

图1 添加不同浓度抗生素和正己酸对细菌抑菌效果的影响

图2 不同浓度的正己酸的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌平板涂布

2.2 正己酸对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长动力学的影响（见图3）

如图3 所示，经正己酸处理后，大肠杆菌生长延滞期延迟（图3A），其中1/2MIC组其生长期在8 h时结束，其在对数生长期的生长速率和空白组相比也较低，24 h 时，其浓度较空白组相比明显降低。当正己酸浓度为1 000 μg/mL 时，大肠杆菌生长被完全抑制。金黄色葡萄球菌（图3B）经正己酸处理后，生长延滞期延迟，其中1/2MIC组其生长期在10 h时结束，其在对数生长期的生长速率和空白组相比也相对降低，24 h时，其浓度较空白组相比明显降低。

图3 正己酸处理后大肠杆菌及金黄色葡萄球菌24 h的生长曲线

2.3 正己酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径影响（见表2和图4）

由表2和图4可知，当正己酸的浓度为1 600 μg/mL时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对正己酸均为中度敏感；当正己酸的浓度为1 300 μg/mL时，大肠杆菌对正己酸为中度敏感，金黄色葡萄球菌对正己酸为低度敏感；当正己酸浓度为1 000 μg/mL，时大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对正己酸均为低度敏感；当正己酸浓度为700 μg/mL 时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对正己酸均为低度敏感。

图4 不同浓度正己酸下牛津杯抑菌圈直径

表2 不同浓度正己酸下牛津杯抑菌圈直径（cm）

2.4 正己酸对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌微观结构的影响（见图5）

扫描电镜结果显示（见图5），经正己酸处理后，金黄色葡萄球菌的形态发生了明显的改变，但大肠杆菌表面并未出现明显的破损。空白组图5A、图5B（金黄色葡萄球菌）和图5E、图5F（大肠杆菌）细胞形态完整、饱满。经过正己酸处理之后，金黄色葡萄球菌表面破损，出现空洞，细胞内容物流出，单位面积下细菌数量减少（图5C、图5D）；大肠杆菌细胞表面并未发生明显改变（图5G、图5H）。可见，正己酸对金黄色葡萄球菌的细胞膜和细胞壁具有一定的破坏作用，而对大肠杆菌的细胞膜和细胞壁没有明显的破坏作用。

图5 空白组大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和正己酸处理后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌Mag=25.00k×和Mag=100.00k×电镜照片

3 讨论

中链脂肪酸的抑菌特性被广泛应用于食品及畜牧业生产之中。Decuypere[18]等研究发现，在模拟猪胃内环境的体外试验中，当100 g 饲料中含有的混合中链脂肪酸为0.35 g 或0.025 moL 时，能够显著抑制胃内细菌群的生长。中链脂肪酸还被用于抗鸡的弯曲杆菌而添加于鸡的饮水中[19]。Mugabe 等[20]研究表明在青贮象草中添加正己酸或者是正己酸和植物乳杆菌的混合物可以减缓乳酸、乙酸的积累，降低pH和水溶性碳水化合物的分解，同时也降低了青贮饲料中氨氮和乙醇浓度的积累，此正己酸或者是正己酸与乳杆菌的混合物还具有抗真菌作用，提高青贮饲料品质，在青贮过程中持续存在。Api等[21]对正己酸的遗传毒性、生殖毒性、光毒性/光过敏性、环境安全进行了评估，结果表明正己酸不具有生殖毒性；在目前申报使用水平下对皮肤不存在过敏性等安全问题；基于紫外光谱评估的光毒性/光过敏性结果表明正己酸不具有光毒性/光过敏性；根据其目前在北美的使用量，对环境影响进行风险评估，表明其风险商数<1。

在本试验中，己酸对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，己酸对大肠杆菌的MIC 为700 μg/mL，MBC 为1 000 μg/mL，正己酸对金黄色葡萄球菌的MIC 为1 000 μg/mL，MBC 为1 300 μg/mL；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的24 h 生长曲线表明己酸能够延迟大肠杆菌/金黄色葡萄球菌的生长延滞期、降低生长对数期的生长速率、降低其在24 h 时的菌液浓度；抑菌圈结果显示1 600 μg/mL 的正己酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有中等抑制作用，随着浓度降低，抑菌圈直径也逐渐减小。在电镜下金黄色葡萄球菌明显受到正己酸的抑制作用，并且细胞外表面被严重破坏，大肠杆菌细胞膜却未见破坏，但却被明显抑制。

Projan 等[22]和Peterson 等[23]认为G+细菌细胞壁肽聚糖含量较高，交联度较高，含有亲水基团的有机酸较易透过细胞壁作用于细胞膜而发挥作用，达到抑菌效果。曾哲灵等[24]认为，革兰氏阴性菌表面有一层脂多糖，可以阻止有机酸对革兰氏阴性菌的作用。有研究表明当大肠杆菌等革兰氏阴性菌的脂多糖外膜被破坏之后，有机酸对大肠杆菌的抑制作用更加显著。Kim 等[25]通过构建产正己酸大肠杆菌，通过微调乙酰辅酶A 乙酰基转移酶（AtoB）基因的表达水平，优化乙酰辅酶A 的代谢流向，而提高大肠杆菌的正己酸产量。因此，可能是由于大肠杆菌表面的脂多糖能够降低大肠杆菌对正己酸的敏感性，所以导致在较高浓度下大肠杆菌仍然能够保持细胞壁及细胞膜的完整性。

有机酸发挥抑菌作用的机理主要包括：①作为一种很好的阴离子表面活性剂，其能够进入到细胞的磷酸双分子层中，破坏细胞膜结构而使细胞死亡；②通过细胞膜渗透入细胞中，解离出H+，使细菌消耗大量能量，泵出H+，以维持细菌细胞内的酸碱平衡，造成细胞代谢阻塞和衰竭，引起细菌细胞死亡，或者当泵出的H+不足以抵消进入细菌细胞的H+时，造成对pH 敏感的细菌死亡；③抑制细菌内部脂肪酶活性，减少细菌在动物肠道绒毛上的附着[26]；④中链脂肪酸在细菌内还可以引起解偶联作用；⑤抑制革兰氏阳性菌的活性，诱导其产生一种自溶酶，使细菌分解死亡[27]。

4 结论

本试验证明了正己酸对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌有明显的抑制作用，为其在生产实践中的应用提供了参考，但其作用机理尚未阐明，还有待进一步研究。