不同澳洲坚果种质果仁氨基酸组成分析与评价

张涛， 宋海云， 贺鹏， 韦媛荣， 许鹏， 谭秋锦，郑树芳， 覃振师， 陆宇明， 王文林*

（1.广西农业科学院广西南亚热带农业科学研究所，广西 崇左 532415；2.广西农业科学院园艺研究所，南宁 530007）

澳洲坚果（Macadamia ternifoliaF.Muell.）是热带、亚热带多年生的常绿乔木果树［1］，又名夏威夷果、昆士兰坚果，原产于澳大利亚昆士兰州东南部和新南威尔州北部沿海的亚热带雨林地区，为山龙眼科（Proteaceae）澳洲坚果属（Macadamia）。我国于20世纪70年代引进并开始在云南、广东、广西等地种植［2］。目前，我国澳洲坚果种植面积居世界第一位，已被国家列入特色木本粮油推广种植树种，是适宜地区特色产业的重要收入来源和脱贫致富的主要途径［3］。

澳洲坚果果仁营养丰富，有独特的奶油香味，是世界上品质较佳的食用果之一。澳洲坚果果仁脂肪含量高［4］，同时也是很好的蛋白质来源，所含必需氨基酸的量可以满足成人和儿童每日所需［5］。郭刚军等［6-7］采用氨基酸自动分析仪、凯氏定氮法及蒽酮−硫酸法等方法研究了澳洲坚果粕的营养成分和氨基酸组成，结果显示，澳洲坚果粕中含有17种氨基酸，包含全部人体必需氨基酸，且配比均衡，可作为人体氨基酸营养平衡的优质食品原料；杜丽清等［8-9］采用全自动氮基酸分析仪研究了澳洲坚果果仁氨基酸组成，发现澳洲坚果果仁富含17种氨基酸，其中包含7种人体必需氨基酸，且必需氨基酸占氨基酸总量的比例稳定，主要以脂肪族氨基酸为主，芳香族和杂环族氨基酸也占有较大的比例；宋海云等［10］采用全自动氮基酸分析仪研究了不同日期采摘的不同品种澳洲坚果果仁的氨基酸组成，结果显示，澳洲坚果果仁中含有7种人体必需氨基酸，其中蛋氨酸含量在不同品种间差异较大，且必需氨基酸含量与氨基酸总量呈显著正相关关系，各种氨基酸的比例均衡且有较高的营养价值。以上研究表明，无论是澳洲坚果果仁还是压榨去油后的果粕，均含有人体必需氨基酸，且种类齐全、配比均衡稳定，部分种类氨基酸含量在不同品种间存在差异。因此，根据氨基酸组分差异筛选某种必需氨基酸或者功能性氨基酸含量高的优良澳洲坚果品种在理论上是可行的，这将有助于澳洲坚果优良品种的选育和种植推广，对澳洲坚果资源的高值化利用也具有重要指导意义。

本课题组在前期试验中发现，GR1、JW、B7等10份澳洲坚果种质的农艺性状较优，其果仁蛋白质含量较高。本研究以这10份澳洲坚果优良种质为试验材料，通过检测分析不同澳洲坚果种质的氨基酸组成及含量，结合系统聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘法−判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）［11-15］等多元统计分析方法对不同澳洲坚果种质的氨基酸品质特征展开分析评价，以期了解不同澳洲坚果种质与其果仁氨基酸组分之间的关系，为选育适合氨基酸饮料加工的澳洲坚果品种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取种植于广西南亚热带农业科学研究所澳洲坚果种质资源圃的GR1、JW、B7、B4、B3、A4、HJ、A16、A38、SH 共10份澳洲坚果优良种质，于2019年9—10月每份种质选取长势树形相近的15株树，每5株为一个生物学重复，即每份种质3次重复，在果树东、南、西、北4个方向，分别选取果实大小相对均匀、成熟度基本一致且无病虫害的果实鲜样。样品带回实验室脱外层青皮后，低温烘干至果仁水分降至1.5%±0.5%后取出，自然晾干真空包装备用。

试剂：6 mol·L−1盐酸溶液、100 nmol·mL−117种混合氨基酸标准溶液（百灵威科技有限公司）、茚三酮染色剂、500 g·L−1氢氧化钠溶液和pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液［c（Na＋）＝0.2 mol·L−1］。

1.2 主要仪器与设备

澳洲坚果开果器、高速万能粉碎机（温岭市百乐粉碎设备厂）、AR224NC型万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）、全自动氨基酸分析仪（日本日立公司）、GZX-9246MBE电热鼓风干燥箱（日本日立公司）、氮气吹扫仪（杭州安研仪器制造股份有限公司）、Vortex-Genie2T型美国SI涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）、恒温水浴锅［冠森生物科技（上海）有限公司］。

1.3 试验方法

1.3.1 水解氨基酸的制备 参考宋亚康等［16］的方法制备水解氨基酸，并略加改动。准确称取澳洲坚果果仁粉碎样品0.600 0 g于水解试管中，加入 6 mol·L−1的盐酸溶液 15 mL，置于涡旋振荡器混匀；再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5 min后抽真空（接近0Pa），充入氮气，重复抽真空−充入氮气3次后，在充氮气状态下封口，封口状态下置于电热鼓风干燥箱中110℃消化24 h；取出冷却后将溶液倒入50 mL容量瓶中定容，准确吸取1 mL样品液于15 mL试管内，60℃水浴使酸完全蒸发；最后加入2 mL柠檬酸钠缓冲液（pH 2.2）到干燥后试管内溶解，震荡混匀后，吸取溶液通过0.45µm滤膜过滤，过滤后的样品液备用。

1.3.2 水解氨基酸的检测 采用全自动氨基酸分析仪对样品水解氨基酸的组成和含量进行检测。

1.4 数据统计与分析

1.4.1 数据统计 采用Excel 2007软件对数据进行整理统计。采用SPSS 26.0对数据进行单因素方差分析，采用邓肯氏复极差测验法（Duncan’s multiple-range test）进行检验［17-18］。

1.4.2 聚类分析 根据不同澳洲坚果种质果仁样品中氨基酸组成及含量测定结果，采用SPSS 26.0软件对不同澳洲坚果种质果仁样品进行聚类分析，所用方法为Ward法和欧氏距离平方法［19-21］。

1.4.3 判别分析 采用SIMCA 14.1软件对聚类结果进行OPLS-DA分析，筛选特征性氨基酸组分［22-24］。

2 结果与分析

2.1 不同澳洲坚果种质果仁氨基酸的组成与含量

对不同澳洲坚果种质果仁氨基酸组成及含量、氨基酸总量、必需氨基酸总量和药效氨基酸总量进行分析，结果（表1）表明，澳洲坚果果仁中氨基酸种类齐全，含有17种氨基酸组分，其中，必需氨基酸7种，半必需氨基酸2种，药效氨基酸9种。Glu、Arg、Asp、Leu、Gly 5种氨基酸在各澳洲坚果种质果仁中的平均含量较高；His、Cys、Met在各澳洲坚果种质中的平均含量较低。

表1 不同澳洲坚果种质果仁氨基酸组成及含量Table1 Amount and composition of amino acid of Macadamia ternifolia among different germplasms

对10份种质进行比较，JW中 Lys、His、Arg、Asp、Ser、Glu、Pro、Ala、Asp、Leu含量最高，其中，Leu含量与B7、A38差异不显著，但显著高于其他种质（P＜0.05），Arg和Glu含量显著高于其他种质（P＜0.05），氨基酸总量和药效氨基酸总量也最高，显著高于其他种质（P＜0.05）；A38中必需氨基酸总量最高，与B7、HJ和SH差异不显著，但显著高于其他种质（P＜0.05）；A4中氨基酸总量、必需氨基酸总量和药效氨基酸总量均最低，显著低于其他种质（P＜0.05）。

从不同澳洲坚果种质间各氨基酸含量的变异系数看，Cys、Pro、Glu、Tyr、Arg变异系数较大，Val、Ala变异系数较小，表明澳洲坚果不同种质果仁中 Cys、Pro、Glu、Tyr、Arg含量差异较大，Val、Ala含量的差异相对较小；药效氨基酸总量变异系数较大，其中Glu、Arg两种药效氨基酸含量的变异系数排在前两位；氨基酸总量的变异系数次之；必需氨基酸总量变异系数最小，但必需氨基酸中Met含量的变异系数较大，表明澳洲坚果果仁中药效氨基酸总量在不同种质间差异较大，其中Glu和Arg两种药效氨基酸的差异明显；不同种质间氨基酸总量差异次之；不同种质间必需氨基酸总量的差异性相对较小，但Met在不同种质间差异较大。

2.2 聚类分析

对10份澳洲坚果种质进行系统聚类分析，结果（图1）表明，当类遗传距离为10时，10份澳洲坚果种质明显地被划分为2类：第Ⅰ类包含B4、B3、A16和A4，占总材料数的40%；第Ⅱ类包括GR1、B7、SH、HJ、A38和JW，占总材料数的60%。

图1 不同澳洲坚果种质的系统聚类分析谱系Fig.1 Dendrogram of HCA of Macadamia ternifolia nuts among different germplasms

对不同类群澳洲坚果种质氨基酸含量的平均值进行分析，结果（表2）表明，第Ⅱ类群的17种氨基酸和3类氨基酸的平均值均高于第Ⅰ类群，其中，Arg、Glu含量及氨基酸总量、必需氨基酸总量、药效氨基酸总量在两类群间存在显著差异，表明第Ⅱ类澳洲坚果种质的氨基酸综合品质更好。

表2 不同类群澳洲坚果种质的氨基酸含量Table 2 Contents of amino acids in different cluster of Macadamia germplasms （g·100 g−1）

2.3 聚类结果的OPLS-DA

2.3.1 建立基于氨基酸组分判别2类澳洲坚果种质的PLS-DA模型 以17种氨基酸和3类氨基酸数据为X变量，10份澳洲坚果种质为Y变量进行OPLS-DA分析，建立氨基酸组分与2类澳洲坚果种质样本之间的关系模型，通过S-plot图初步筛选具有代表性的氨基酸组分，观察置换20次检验图的直线斜率判定模型是否存在过拟合现象，并通过计算变量投影重要度（variable important for the projection，VIP）判别各氨基酸组分对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，筛选特征性氨基酸组分［24-28］。

由图2可知，各澳洲坚果种质聚类趋势明显，即建立的PLS-DA模型有良好的拟合参数，其中R2x为 0.932，R2x越接近 1，模型越稳定；R2Y为0.758，R2Y越大，模型的解释能力越强，样本可信度全部处于95%置信区间内；Q2为0.641，Q2大于0.5，说明模型的预测能力较强。

图2 澳洲坚果种质OPLS-DA得分图和Hotelling T2分布图Fig.2 OPLS-DA score scatter plot and Hotelling T2distribution plot of Macadamia germplasms

2.3.2 模型的可靠性验证 分别对2类澳洲坚果种质的判别模型进行20次置换后验证，结果（图3）表明，2个模型Q2的一元线性回归曲线在纵轴上的截距均小于零，说明2个模型均不存在过拟合现象，模型可靠，可用于2类澳洲坚果种质的判别分析。

图3 PLS-DA模型置换验证Fig.3 PLS-DA model replacement validation plots

2.3.3 对2类澳洲坚果种质的判别起关键作用的氨基酸组分鉴定 图4A是OPLS-DA分析得到的二维载荷图，反映了各变量对不同澳洲坚果种质果实在得分图上分布的影响，离密集区越远的变量对样本区分的影响越大，同时每一类别（Y）附近的变量（X）均在该类别的样品中相对含量较大［24］。图4B是变量重要性VIP值图，通常认为VIP＞1.0的变量在判别过程中具有重要作用［24］，VIP值越大，所对应的氨基酸组分在不同澳洲坚果种质果实间的差异越显著。结合图4，确定有5种氨基酸组分VIP值大于1，分别为Glu、Arg、氨基酸总量、必需氨基酸总量和药效氨基酸总量，这些组分离密集区较远，属于组间差异显著的特征性组分。由图4还可知，变量（X）明显靠近Y（Ⅱ），表明20种氨基酸组分在第Ⅱ类澳洲坚果种质中相对含量较高，其中Glu、Arg和Asp含量及氨基酸总量、必需氨基酸总量、药效氨基酸总量最为明显。

图4 澳洲坚果种质氨基酸组分OPLS-DA得分图和VIP值Fig.4 OPLS-DA score scatter plot and VIP value of amino acid composition in Macadamia germplasms

3 讨论

Mahesh等［29］对杏仁、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、美洲山核桃、松子、开心果、核桃、弗吉尼亚花生10种坚果仁中的氨基酸组成及含量进行了检测分析，均检测出包括Trp在内的18种氨基酸，且均含有7种人体必需的氨基酸，其中Glu、Arg和Asp 3种氨基酸的平均含量在10种坚果仁中均排在前3位；杏仁中Glu含量最高，松子中Arg含量最高，弗吉尼亚花生中Asp含量最高。杜丽清等［8］对湛江地区5个澳洲坚果主栽品种（HAES 246、HAES 800、H2、O.C、own venture）果实样品的氨基酸含量进行了差异性分析，发现5个品种的果仁均含有17种氨基酸，未检测到Trp，其中Glu含量最高，Arg次之，Asp第3；各品种均含有7种人体必需的氨基酸，且人体必需氨基酸占总氨基酸比例的变异系数很小；在7种人体必需氨基酸中，Met含量的变异系数最大，Phe的变异系数最小。本研究从10份澳洲坚果种质果仁样品中也只检测到17种氨基酸，其中Glu、Arg、Asp 3种氨基酸含量较高；同时也含有7种人体必需的氨基酸，必需氨基酸总量变异系数较小，其中Met含量的变异系数最大，与前人研究结果相一致，表明各类坚果的氨基酸组成差异较小，但含量存在显著差异。本研究未检测到Trp，这可能与试验方法有关。本研究还对不同澳洲坚果种质果仁样品的药效氨基酸进行了分析，表明药效氨基酸总量变异系数较大，其中Glu和Arg药效氨基酸含量的变异系数较大。药效氨基酸含量的丰富变异为选育功能性氨基酸（Glu、Arg）含量高的优良澳洲坚果品种提供了可能与依据。

谭秋锦等［30］对12份澳洲坚果种质（GR1、JW、B7、B4、B3、A4、HJ、344、788、A16、A38、SH）果仁的10个主要营养成分进行了变异分析、相关分析、主成分分析和聚类分析，结果表明，在不同澳洲坚果果仁的营养成分中，矿物质、蛋白质、氨基酸和脂肪差异明显，并将12份种质聚为3类，并筛选出3个果实综合品质较好的种质（B7、B4和JW），其中，B7和JW的矿质元素、蛋白质和氨基酸含量较高。本研究对10份澳洲坚果种质也进行了聚类分析，结果将10份澳洲坚果种质聚为2类，其中，第Ⅱ类（GR1、B7、SH、HJ、A38、JW）氨基酸综合品质较高；OPLS-DA分析进一步验证了系统聚类结果，并发掘出2类间差异显著的特征性氨基酸组分，再次证明第Ⅱ类澳洲坚果种质的氨基酸综合品质较好，可作为选育适合功能性氨基酸饮料加工的澳洲坚果品种的种质资源，为澳洲坚果的有效选育以及澳洲坚果氨基酸的高值化利用供理论支撑。