水稻新型育种技术研究现状与展望

马小倩， 杨涛， 张全， 张洪亮*

（1.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023；2.中国农业大学农学院，北京 10019）

遗传、变异和选择是作物育种的3个核心：遗传是育种的本质，变异是育种的基础，而选择则是育种的关键。育种即是通过解析性状的调控基因，研究基因间的互作关系，并进一步将不同品种中的优良基因进行聚合，从而选育综合性状优异的新品种［1］。

遗传学及生物技术的迅猛发展使作物育种的方法和技术也不断得到改良和提高，从传统的杂交育种到诱变育种、分子标记辅助育种以及转基因育种等［2］。近年来，随着分子生物学、基因组学以及生物信息学等学科的飞速发展，逐步发展出一些新的育种方法，如基因编辑育种、分子设计育种等［3］。水稻是重要的粮食作物之一，2002年水稻基因组测序初步完成，大量的基因组数据和高密度的分子标记遗传图谱为水稻新技术育种奠定了良好的基础。本文着重总结了几种新型育种技术在水稻中的应用，并对其发展前景进行了展望，以期为水稻种业发展奠定基础。

1 分子标记育种

分子标记是指以核苷酸序列变异为基础的遗传标记，其能够直接反映个体基因组DNA的差异。经典的分子标记主要包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence）、SSR （simple sequence repeat）、STS （sequence-tagged sites）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragments length polymorphism）、SNP（single nucleotide polymorphisms）和 InDel（insert and deletion）等［4］。近年来，单倍型也发展成为一种新型的分子标记，单倍型为来自同一基因区段或单个染色体上多个标记的组合或是来自不同染色体上控制同一目标性状的标记组合［5］。Huang等［6］利用517份水稻品种大约360万SNPs数据，构建了单倍型图谱。

利用分子标记育种技术，水稻的产量、品质及生物和非生物胁迫抗性等方面得到了改良。国家杂交水稻工程技术研究中心以马来西亚普通野生稻为供体亲本、以93-11为受体亲本进行杂交和回交，通过分子标记辅助选择技术育成了携带野生稻增产QTLyld1.1和yld2.1的新品系R163；然后利用R163与光温敏不育系Y58S育成优质、高产、广适杂交稻新组合Y两优7号［7］。品质方面，周屹峰等［8］以优质保持系宜香1B和协青早B为亲本，以特异性分子标记对直链淀粉含量进行间接筛选，选育出不育系浙农3A，其稻米品质得到了极大的改良；王岩等［9］基于控制稻米糊化温度的alk基因和控制香味的fgr基因编码区，开发InDel标记用于辅助选择育种，经回交聚合将alk和fgr片段导入明恢63，使稻米的外观品质和蒸煮食味品质得到了显著改善；刘巧泉等［10］通过向特青中导入Wx基因，选育出仍保持原有亲本主要农艺性状的3个优质品系，改良品系的直链淀粉含量显著降低，蒸煮食味品质显著提高。抗病虫方面，Liu等［11］利用与Pi1连锁的分子标记对珍汕97B进行稻瘟病抗性改良，共得到17个含有抗性基因Pi1的改良珍汕97B株系；杨子贤等［12］利用分子标记辅助选择将Xa21基因和Bt基因同时导入93-11，使93-11对白叶枯病和螟虫的抗性明显提高；陈学伟等［13］利用分子标记选择将抗病基因Pi-d（t）1、Pi-b和Pi-ta2聚合到优良保持系材料冈46B中，大大提高了水稻抗病育种的效率；倪大虎等［14］通过分子标记辅助选择和抗性鉴定，将抗白叶枯病基因Xa21和稻瘟病抗性基因Pi9（t）聚合到同一品系，获得同时抗稻瘟病和白叶枯病的稳定纯合株系；官华忠等［15］通过分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9导入金山B-1，选育出5个稻瘟病抗性显著高于金山B-1的近等基因系；董巍等［16］将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2从供体中回交聚合到培矮64S中，改良株系对稻瘟病抗性明显增强；陈英之等［17］将来源于普通野生稻的5个抗稻飞虱（brown plant-hopper，BPH）基因通过杂交、回交和分子标记辅助选择导入杂交水稻亲本中，其苗期和成株期都表现出对BPH的高抗性。通过分子标记选择育种，广东省农业科学院选育出了一批优良的不育系和恢复系品种，如吉丰A、广泰A、广恢508、广恢501等［18］。

分子标记育种对水稻产量、品质和抗性育种具有重要意义，而QTL（quantitive trait locus）的精确定位是分子标记育种的基础。目前，精细定位并成功用于实际育种中的QTL大部分是主效QTL，许多微效QTL则较少被利用。此外，标记性状多集中于质量性状，数量性状发展相对滞后。大量遗传信息处于零散状态以及育种群体较难达到精细定位作图群体标准等问题制约着分子标记育种的发展。未来，随着生物技术的不断进步，分子标记育种与基因编辑和转基因技术相结合，将更加精准、高效地促进水稻的育种进程。

2 转基因育种

转基因育种技术是利用植物基因工程技术将作物高产、优质和抗逆等相关基因导入受体作物中以培育出具有特定优良性状的新品种。由于优异基因可来源于任意物种，因此，转基因育种可以打破种间隔离，解决物种间远缘杂交不亲和问题［19］。我国的转基因育种始于20世纪80年代，“863”计划项目实施之后，转基因育种研究发展迅猛。目前，水稻转基因育种使用的转基因方法主要包括：农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电击导入法和花粉管通道法，其中农杆菌介导法占主要地位。

目前，水稻应用转基因育种改良的性状主要集中于抗虫、抗病、品质改良等。应用于水稻抗虫性改良的外源基因主要有苏云金杆杀虫结晶蛋白基因（Bt）、昆虫蛋白酶抑制剂（基因PI）和植物凝集素基因、营养杀虫蛋白基因、淀粉酶抑制剂基因、昆虫毒素基因、几丁质酶基因等［20］。其中，Bt基因是目前应用最为广泛和成功的抗虫基因。1995年，华中农业大学开始研发无标记抗虫转基因水稻，利用基因枪法将人工合成的Bt杀虫基因（cry1Ab/cry1Ac）转入明恢63，培育出抗虫转基因水稻华恢1号；继而以华恢1号为父本、珍汕97A为母本选育出杂交种Bt汕优63，华恢1号和Bt汕优63均表现出较强的抗虫性。应用于水稻抗病性改良的基因主要包括抗病毒基因、抗真菌病毒基因和抗细菌病毒基因3类。几丁质酶是目前研究和应用最为广泛的一种病程相关蛋白，过量表达病程相关蛋白是抗真菌病害常用的策略。冯道荣等［21］将水稻碱性几丁质酶基因RC24、RCH10和酸性几丁质酶基因RAC22、β-1转入籼稻品种七丝软占，获得抗稻瘟病和纹枯病的转基因株系。白叶枯病是影响水稻产量最严重的细菌性病害之一，国家水稻数据中心统计，截止到2021年5月已经鉴定了134个抗白叶枯病基因。翟文学等［22］利用农杆菌介导法将Xa21基因转入5个水稻主栽品种，获得了具有白叶枯病抗性的水稻株系。

我国转基因水稻育种虽取得一定进展，但多数仍处于实验室研究阶段，离生产实践还有很大距离。将转基因技术应用于作物育种，仍需与常规育种相结合。随着转基因技术的发展，多基因聚合是转基因育种发展的必然趋势。虽然转基因育种已经在棉花和大豆等作物上实现商品化，但人们对转基因作物的安全性依然存在较多顾虑，阻碍了转基因水稻商品化的发展［23-24］。因此，需要建立科学、合理、公正的安全性评价体系，对转基因水稻进行正确的安全性评价，消除人们对转基因作物安全性的忧虑，推动作物转基因育种的发展。

3 基因编辑育种

基因编辑技术是利用工程核酸酶诱导基因组产生DNA双链断裂，激活细胞内源修复机制，实现对基因组的精确修饰，如插入、缺失或替换等［25］。基因编辑系统主要有锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）系统、类转录激活因子效应物核酸酶（transcriptional activator-like effector nuclease，TALENs）系统和规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）系统［26］，3种编辑系统的比较详见表1。与前两种编辑系统相比，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、效率高和成本低等优点［27］。

表1 三种基因编辑系统的比较Table 1 Comparison of three gene-editing techniques

目前已有不少关于CRISPR/Cas9系统在水稻育种应用中的研究［28-29］。目前，水稻利用基因编辑育种主要应用于抗逆性、品质、产量以及抽穗期等方面（表2）。抗性方面，徐鹏等［30］利用CRISPR/Cas9系统对Pita、Pi21和ERF922基因同时进行编辑，对获得的三突变纯合株系表型鉴定发现，突变株系较野生型稻瘟病抗性显著提高；Li等［31］利用CRISPR/Cas9系统对稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1进行编辑以抑制该基因的表达，突变体植株稻瘟病抗性得到显著提高；Sun等［35］将ALS基因进行基因编辑得到具有除草剂抗性的突变体植株。品质方面，Li等［36］和范美英等［37］利用CRISPR/Cas9 系统对Wx基因进行编辑，突变体籽粒直链淀粉含量发生变化，但对产量无显著影响；邵高能等［38］利用CRISPR/Cas9系统对中花11的香味基因Badh2进行编辑，突变体籽粒中香味物质含量显著增加，且不影响稻米的蒸煮食味品质；祁永斌等［39］对水稻品种嘉58和秀水134的香味基因Badh2进行编辑，突变体籽粒中2-AP含量极显著地高于野生型，其香味性状得到明显改良。高产方面，Shen等［41］利用CRISPR/Cas9系统对5个粳稻品种的GS3和GN1a基因同时进行编辑，发现5个背景下gs3和gs3gn1a纯合突变体的籽粒长度均显著增加，且gs3gn1a比gs3纯合突变体具有更多的穗粒数；Li等［42］对穗粒数基因GN1a、穗型基因DEP1、粒型基因GS3和株型基因IPA1进行编辑，发现T2代gn1a、dep1、gs3突变体分别出现穗粒数增多、直密穗和大粒的表型，在dep1和gs3突变体中还观察到半矮杆和长芒表型，而ipa1突变体表现出分蘖增多和分蘖减少两种表型。抽穗期方面，Li等［51］设计双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，对7个水稻品种中抽穗期调控基因Hd2、Hd4和Hd5进行编辑，发现3个基因同时突变的纯合株系抽穗期与野生型相比均有不同程度的提前；进一步研究表明，Hd2、Hd4、Hd5、Dth2和Hd18为主要的开花促进因子［45］。

表2 水稻利用基因编辑育种涉及的部分基因Table 2 Related genes in rice breeding using gene editing

目前，CRISPR/Cas9已发展为主流的基因编辑系统。基因编辑是通过定向敲除目标靶基因，造成基因功能缺失从而实现对目标性状的改良。作物育种过程中，育种家往往通过聚合一些优良基因或者定点替换某些基因使得产量、品质和抗性等得到提高，高效精准的基因编辑系统极大地促进了基因编辑育种在作物改良中的应用，对未来水稻育种具有重要意义［52］。

4 分子设计育种

随着分子生物学和测序技术的发展，大量目标性状基因被克隆［53］、基因间互作网络被解析，使得分子设计育种成为可能。科学家可以在实验室内提前模拟、筛选和优化品种选育过程，实现从传统“经验”育种到设计“精准”育种的转变，极大地提高育种效率［54］。万建民［54］和Wang等［55］提出分子设计育种，主要包括以下流程：①明确调控育种目标性状的基因或QTL；②根据基因的位置、遗传效应、基因间以及基因与环境间的互作等信息，模拟和预测可能出现的各种基因型组合形成的表现型，从中选择符合预期表现型的基因型组合；③对选出的目标基因型组合进行育种途径分析，制定合适的育种方案；④根据育种方案进行实践育种。综上所述，分子设计育种是将分子标记育种、转基因育种和传统育种相结合的一种新型育种模式［56-58］。Tian等［59］对水稻食味及蒸煮品质相关基因及其调控网络进行了研究，之后李家洋院士团队又经过8年努力将控制产量、品质、外观等多个优异基因聚合，成功培育出比LYP9高产、优质的水稻品种，该品种的成功培育对分子设计育种具有重要的指导意义［60］。

5 展望

近年来，在可利用耕地面积逐年减少和严峻的环境条件下，确保不断增长人口的粮食安全仍将是一个巨大的挑战。为了迎接这个挑战，水稻育种需要对大量基因资源进行集中整合，结合作物高通量表型和生物技术方法（如分子标记辅助选择、基因组选择和基因编辑）等对水稻生长进行剖析。针对新时期水稻产业发展战略需求，强化水稻育种的基础研究，综合全基因组选择、基因编辑、诱变育种、杂交育种等育种技术，以基因敲除、单碱基编辑等基因编辑手段，创新和优化水稻基因编辑技术；完善多性状基因聚合的转基因技术；通过生物技术、基因组测序技术等，以全基因组选择为主线，完善水稻分子设计育种技术，推动水稻育种逐渐向高效、精准、定向的方向转变，加速水稻超级新品种的培育进程。