转基因复合抗虫耐除草剂玉米BFL4-1的分子特征及功能评价

邹俊杰， 徐妙云， 张兰， 郑红艳， 王磊，2*

（1.中国农业科学院生物技术研究所，农业农村部农业基因组学重点实验室（北京），北京 100081；2.三亚中国农业科学院国家南繁研究院，海南 三亚 572024）

通过转基因技术可以获得具有抗虫、耐除草剂、抗病、抗逆性、适应性、高产、高营养价值等新性状的作物品种［1］。转基因作物的应用能够有效提高农业生产力，降低干旱、洪涝和病虫害等对作物生产的不利影响，提高单位面积产量，减少农药化肥的使用及其对环境的污染［2］。国际农业生物技术应用服务组织（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）2018年报告中指出，自1996年转基因作物开始商业化种植以来，全球转基因作物的种植面积增长了约113倍，累计达到了25亿hm2，转基因作物为消费者提供了多样性的选择，在粮食安全、可持续发展及气候变化等方面作出了贡献［3］。

转基因作物的研究呈现多基因、多性状叠加趋势，即由转化单一基因向多基因发展，表现的性状由单一性状向复合性状发展［4］。复合性状转基因植物能够同时表达2个或多个外源基因，聚合多个优良性状，能够有效提高资源利用效率，带来多重收益。国际上已有约120个复合转化体批准商业应用，复合的性状以抗虫抗除草剂、多基因抗虫复合为主，涉及的作物主要包括棉花、玉米、大豆和油菜等［5］。聚合抗虫、耐除草剂、耐干旱胁迫，加上营养改良等性状的复合性状转基因产品是未来转基因作物育种的重要发展方向［6］。2018年，具有复合性状的转基因作物种植面积占转基因作物总面积的42%［3］。

玉米是我国主要粮食作物之一，玉米螟等虫害和杂草严重影响玉米的生长、产量和品质。利用转基因技术培育具有抗虫、耐除草剂性状的玉米是控制害虫和防除杂草的有效途径。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性昆虫病原体，对哺乳动物等非靶标生物安全无害，cry、cyt和vip基因编码的杀虫蛋白是主要活性物质，表达Bt杀虫蛋白的转基因植物已被广泛应用于害虫的防治［7］。草甘膦（glyphosate）可有效地清除杂草，cp4epsps来源于土壤根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）CP4株系，其编码蛋白CP4EPSPS（5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）对草甘膦不敏感，导入cp4epsps能使转化体耐受草甘膦，在耐除草剂转基因育种中被广泛应用［5］。我国自2008年启动转基因生物新品种培育重大专项以来，已获得了众多具有知识产权的转基因抗虫和耐除草剂玉米优良转化体，这为培育具有突破性的玉米新品种创造了条件［2］。这些具有抗虫耐除草剂复合性状的转基因玉米材料进入到环境释放、生产性实验和安全证书申报等不同阶段。2019年12月，大北农DBN9936以及杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学申报的双抗12-5抗虫耐除草剂玉米获得农业农村部颁发的农业转基因生物安全证书，转基因玉米品种审批有望加快推进。本课题组前期研究构建了cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因串联表达载体，并通过农杆菌介导法转入玉米中，经过筛选获得具有抗虫、耐草甘膦复合抗性的转基因玉米材料BFL4-1。本研究利用全基因组测序和侧翼序列测序对外源片段插入位置进行了分析，对cry1Ab、cry1F、cp4epsps基因在BFL4-1转基因材料的分子特征和遗传稳定性进行了分析，同时对转基因玉米的抗虫和耐除草剂性能进行了评价，旨在为培育具有抗虫和耐除草剂复合性状的玉米新品系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4-1由本课题组创制，BC4F1、BC5F1和 BC6F1为 BFL4-1 不同回交世代材料。非转基因对照材料为玉米自交系郑58（Zheng 58）由本课题组保存。试验在中国农业科学院生物技术研究所温室和位于海南省三亚市乐东县尖峰镇的中国农业科学院生物技术研究所试验基地进行，转基因材料种植管理严格按照《农业转基因生物安全评价管理办法》执行，并已备案（农基安办报告字〔2014〕第595号）。每个小区面积为6 m2（2 m×3 m），行距50 cm，株距20 cm，3次重复，播种后按正常栽培管理。

1.2 试验方法

1.2.1 BFL4-1转基因材料的获得 根据玉米的密码子使用频率对抗虫基因cry1Ab、cry1F和抗草甘膦基因cp4epsps的密码子进行了优化，将cry1Ab、cry1F和cp4epsps3个基因表达框构建到植物表达载体pCAMBIA1300上（图1）。利用农杆菌介导玉米幼胚转化方法［8］将外源基因表达框（大小约11 kb）导入受体玉米材料Hi−II中，经过筛选获得多个T1代阳性植株。利用回交转育的方法将外源插入片段导入自交系郑58中，经过6代回交再自交筛选后获得BFL4多个独立转基因株系，本试验用到的转基因株系为BFL4-1。

图1 cry1Ab、cry1F和cp4epsps插入表达框的结构Fig.1 Structure of T-DNA region containing cry1Ab，cry1F and cp4epsps expression cassettes

1.2.2 PCR检测转基因植株 取玉米幼苗期的叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒（DP302-03，全式金公司）提取基因组DNA。用全基因组重测序方法结合生物信息学分析方法［9］确定BFL4-1的插入位置和序列。根据表达框序列及外源序列插入玉米基因组的位置，设计了cry1Ab、cry1F和cp4epsps特异性扩增引物以及BFL4-1外源片段插入基因组特异性检测引物，如表1所示。

表1 本研究中引物序列Table 1 Primers used in this study

PCR（聚合酶链式反应）体系：2×TSINGKE Master Mix 10 µL；正反向引物（10 µmol·L−1）各0.4µL；ddH2O 8.2µL；DNA模板，1µL。PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35个循环；72 ℃，10 min。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 分别提取BFL4-1拔节期根、茎和叶片的RNA并反转录成cDNA，参照试剂盒SV Total RNA Isolation System（Promegam，USA）和反转录参照试剂盒A3500-Reverse Transcription System（Promega，USA）说明书进行。qRT-PCR反应体系按照SYBR PremixExTaqTM（Code DRR041A，TaKaRa公司）荧光定量试剂盒进行，采用ABI 7500荧光定量PCR仪系统（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems，美国）进行荧光定量PCR。实时荧光定量用的引物序列如表1所示，zSSIIb为参照基因，试验结果为3次数据平均值。

1.2.4 外源蛋白免疫试纸条检测 采用美国Agdia公司的Cry1Ab/1Ac、Cry1F和CP4EPSPS试纸条检测BFL4-1转基因材料中的Cry1Ab、Cry1F和CP4 EPSPS蛋白，具体方法参照试剂盒说明书。

1.2.5 农艺性状调查 生长期间调查出苗期、抽雄期和吐丝期，吐丝后测量株高和穗位高。果穗收获后进行考种，测量穗行数和行粒数等农艺性状指标。种子萌发率参照梁海生等［10］方法进行计算。

1.2.6 玉米螟田间抗虫性鉴定 转基因材料及非转基因对照材料生长到大喇叭口期，开始接种亚洲玉米螟，将玉米螟初孵幼虫接于心叶中，每株接虫20～30头，定期观察虫害发生情况。抗虫性标准采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准［11］。亚洲玉米螟初孵幼虫购自中国农业科学院植物保护研究所。

1.2.7 抗草甘膦性能评价 在转基因材料及非转基因的野生型对照材料生长到4～5片叶时，喷施41%的草甘膦异丙胺盐（农达，美国孟山都公司），喷施时按15 mL·L−1药量进行，约为正常用药的5倍。喷施1周后，调查幼苗死亡率。

2 结果与分析

2.1 BFL4-1转基因材料的遗传稳定性检测

将cry1Ab、cp4epsps和cry1F3个基因串联表达，通过农杆菌介导法导入玉米中，经过与郑58回交转育，获得了多个独立的转基因株系，其中包括BFL4-1和BFL4-2。提取BFL4-1和BFL4-2株系不同世代（BC4F1、BC5F1、BC6F1）阳性植株DNA，采用cry1Ab、cry1F和cp4epsps表达框片段特异引物进行目的基因片段扩增，利用BFL4-1外源基因片段特异性PCR对BFL4-1回交转育后代进行了连续3代的跟踪检测，在不同世代均能检测到3个目的基因的特异片段（图2）。这些结果说明，cry1Ab、cry1F和cp4epsps3个基因均已整合到玉米基因组中，并且能够稳定遗传。

图2 在BFL4株系不同世代中cry1Ab、cry1F和cp4epsps片段PCR检测Fig.2 PCR detection of cry1Ab，cry1F and cp4eps expression cassettes in different generations of BFL4 line

2.2 BFL4-1外源片段插入位置鉴定

BFL4-1回交后代PCR检测的阳性植株与阴性植株比例接近1∶1，与单个外源片段插入回交株系理论分离比接近，符合孟德尔遗传规律，说明BFL4-1中外源基因片段插入在玉米染色体基因组上，且为单拷贝插入。

利用新一代的测序技术对转基因植株的插入位置、插入拷贝数、外源基因的完整性和遗传稳定性进行分子特征检测［9］。对获得的BFL4-1进行了高通量全基因组测序和侧翼序列PCR测序分析，并与玉米基因组序列B73 RefGen_v4（http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index）进行比对，发现外源插入片段5’端位于第3号染色体66 921 452 bp附近，外源插入片段位于基因间区。对BFL4-1材料5’端侧翼序列进行特异性PCR检测和测序，扩增片段大小在550 bp左右，与理论片段大小符合，对PCR扩增片段进行测序，测序结果能够比对上玉米基因组序列和插入片段序列，说明BFL4-1特异性引物对可以用于BFL4-1转基因株系的特异性检测。

2.3 BFL4-1材料中cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因相对表达量和蛋白表达检测

cry1Ab、cry1F和cp4epsps3个基因整合在BFL4-1基因组中且能够稳定遗传，为了检测这3个基因在不同组织中相对表达水平，利用qRT-PCR对3个基因在BFL4-1拔节期不同组织的表达量进行了检测。cry1Ab、cry1F和cp4epsps在BFL4-1不同组织中表达量相对稳定（图3）。在成熟期利用Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白特异的免疫试纸条定性检测BFL4-1材料中这3个蛋白的表达情况，检测结果显示在BFL4-1的根、茎、叶和种子中均能检测Cry1Ab、Cry1F、CP4EPSPS蛋白（图3）。这些结果说明，在BFL4-1材料中，cry1Ab、cry1F和cp4epsps在转录和翻译水平上均能够稳定表达。

图3 cry1Ab、cry1F和cp4pesps相对表达量和免疫试纸条检测Fig.3 Relative expression level of cry1Ab，cry1F，cp4pesps and immunostrip tests

2.4 BFL4-1株系田间抗虫和抗除草剂性能鉴定

cry1Ab、cry1F和cp4epsps在BFL4-1株系中高效地转录，并且在植物各个组织部位均有蛋白表达。为了检测BFL4-1是否具有高效抗虫和耐除草剂的性状，对BFL4-1转基因株系的抗虫和耐除草剂性能进行了鉴定。草甘膦喷施一周后，非转基因植株全部死亡，而转基因植株存活率为100%，说明获得BFL4-1为高耐草甘膦的转基因玉米（图4A）。在玉米大喇叭口期进行田间接虫鉴定，结果表明，接虫后非转基因植株叶片虫害严重，而BFL4-1具有较好的抗虫性，根据国际玉米螟协作组制定的抗虫标准分级对BFL4-1的抗虫性进行分级，BFL4-1为高抗玉米螟转基因材料（图4B）。

图4 BFL4-1材料田间耐除草剂和抗虫性能评价Fig.4 Evaluation of herbicide tolerance and insect resistance of BFL4-1 plants in the field

2.5 BFL4-1农艺性状与对照比较

为了研究外源基因片段插入后是否影响玉米农艺性状，对BFL4-1与郑58的生育期、株高、穗位高、穗行数、行粒数和百粒重等农艺性状进行了观察和比较，结果表明，在正常种植条件下，转基因BFL4-1植株与对照郑58在株高、穗位高、生育期、抽雄期、穗行数、行粒数、百粒重以及萌发率无差别，适应性与对照郑58相当，说明BFL4-1与郑58在生存竞争力方面均无明显差异（P＞0.05，表2）。这些结果说明，在正常条件下转基因BFL4-1农艺性状与非转基因对照材料郑58相比未发生变化，没有增加或减少适应性的优势或趋势。在田间农业生产过程中，因BFL4-1可以耐受草甘膦除草剂，同时含有抗虫基因，在玉米螟虫害严重时，其生长性能要优于对照郑58。

表2 BFL4-1与对照郑58农艺性状比较Table 2 Comparison of agronomic traits between BFL4-1 and Zheng 58

3 讨论

来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因需要进行密码子优化才能在玉米中稳定表达，通过提高蛋白表达量来提高转基因玉米的抗虫性能。已有研究报道，根据玉米密码子的偏好性对来自苏云金芽孢杆菌BT8的cry1Ah进行优化，优化后cry1Ah的GC含量提高，并且细菌基因中16处易引起mRNA不稳定的ATTA序列也得到了改造，优化后的cry1Ah与Btcry1Ah基因序列相似性为70%左右［12］。cry1Ab在转基因玉米中存在表达量低、表达产物不稳定和抗虫效果差等问题，通过对cry1Ab基因原始核苷酸序列改造，去掉引起mRNA不稳定及富含AT的序列，并经过密码子优化，能够获得新型的抗虫基因cry1Ab-Ma，并具有很强的杀虫性［13］。通过对Btcry1Ah和G2-epsps基因进行植物密码子优化改造，能够提高转基因玉米的抗虫和耐除草剂性能［11］。本研究获得的转抗虫耐除草剂玉米BFL4-1材料中cry1Ab、cry1F和CP4EPSPS均具有较高的表达，蛋白表达稳定（图3），田间抗虫和耐除草剂试验结果表明转基因玉米材料BFL4-1为高抗玉米螟和耐除草剂的转基因株系（图4）。

具有复合性状成为转基因作物研发的趋势，2018年，复合性状转基因作物的种植面积占全球转基因作物种植面积的42%，越来越受到种植者的欢迎［3］。复合性状转基因植物可以通过共转化、再转化和育种复合3种途径获得，复合的性状以抗虫抗除草剂、多基因抗虫复合为主［5］。目前，具有复合性状的转基因玉米主要通过亲本杂交聚合法、多基因单载体共转化聚合法和多基因多载体共转化聚合法等来获得［14］。国内通过这些方法也获得了具有复合性状的转基因玉米，包括一些抗虫耐除草剂玉米品系［15］等。有些转基因玉米除了抗虫耐除草剂外，还兼具有耐旱性能［16］。通过将cry1Ab、cry1F和cp4epsps串联表达并转入玉米中，整合在染色体上并能够稳定表达，一方面缩短了转基因复合育种的过程；另一方面多基因抗虫，能够延缓靶标生物产生抗性，延长转基因玉米的使用寿命。

本研究获得了具有抗虫耐除草剂复合性状的转基因玉米材料BFL4-1，对其分子特征进行了分析，cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因的表达具有遗传稳定性，且在农艺性状上与对照无显著差异。在今后田间抗虫性鉴定方面，除了玉米螟外，还需要对其他鳞翅目害虫，如棉铃虫、黏虫以及桃蛀螟的抗性进行鉴定，这些害虫也严重影响玉米生长发育［17］。复合性状转基因作物在营养成分含量上与非转基因作物可能存在差异，这可能与转基因作物中包含的多个基因间存在协同、抑制或非关联相互作用有关［18］。后续还需要对转基因玉米BFL4-1进行毒性、过敏性分析及环境安全评价和营养成分分析，为转基因玉米BFL4-1的安全评价申报和培育奠定基础。