精脒对老龄小鼠股骨微结构的影响

苏静克，苏静华，韩 宁，田萧羽，党瑞杰，冯 晋，耿燕秋

骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病，多发于老年人和绝经后女性，骨质疏松患者的支持性骨小梁数目减少、质量下降，极易发生骨折。随着我国人口老龄化的不断加深，老龄性骨质疏松症的患病率呈上升的趋势，防治老龄性骨质疏松对于提高老年人的生活质量具有重要意义。目前治疗骨质疏松的药物主要有雌激素替代物，选择性激素受体调节剂，二膦酸盐和降钙素等。由于这些药物的临床效果有限，而且诸如闭经、子宫内膜癌、皮疹、房颤等副作用限制了其临床应用。因此，迫切需要寻找对于防治骨质疏松安全且有效的替代药物。精脒(Spermidine)是一种广泛分布于自然界的多胺类化合物。既往动物实验发现， Spermidine能延长小鼠寿命并缓解老年性心肌肥大，通过激活AMPK缓解非酒精性脂肪肝病，减缓老龄果蝇的记忆下降。临床研究也表明，随着年龄增长，体内的Spermidine水平呈下降趋势；而且增加含Spermidine丰富食物的摄入能降低因心血管疾病和肿瘤导致的死亡。但Spermidine能否缓解老龄性骨质疏松临床研究较少。本研究拟探讨Spermidine对老龄小鼠股骨微结构的影响，为临床上防治老年性骨质疏松提供新靶点及新药物。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器 选取21月龄雄性SPF级C57BL/6J老龄小鼠20只，体质量27～33 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Spermidine购自美国Sigma公司； 骨源性碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒(美国MyBioSource公司)；LabMaster 呼吸代谢分析系统(德国 TSE 公司)；AU5800型全自动生化分析仪(美国BeckMan公司)；2104 Envision多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)；micro-CT(瑞士SCANCO公司)。

1.2 动物分组及干预 小鼠在解放军总医院实验动物中心清洁级环境中喂养，环境温度(24±1)℃，相对湿度(65±5)%，光照12 h/d。所有动物单笼饲养，自由进食水。动物购回后首先适应性喂养7 d，然后按体重大小排序，奇数纳入对照组(Vehicle，=10)，偶数纳入实验组(Spermidine，=10)。Spermidine组老龄小鼠在饮水中3 mmol/L的spermidine，剂量参照文献[7]，干预时间为12周。

1.3 体质量测量与生化指标检测 每周测量1次各组小鼠的体质量。干预结束前24 h，将两组小鼠置于呼吸代谢笼中，禁食但不禁水，然后收集全部尿液。1500 r/min转速离心3 min，吸取上清液放入液氮中保存。干预结束时，对老龄小鼠按60 mg/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥进行麻醉，剪毛、消毒皮肤、开胸，直视下心脏取血，快速将血液注入黄帽真空促凝采血管，待血液凝固后析出血清，置于液氮中保存。使用全自动生化分析仪检测钙、磷浓度，采用ELISA法检测血清中骨源性ALP的浓度。

1.4 micro-CT分析股骨微结构 取各只小鼠的右侧股骨，清理表面皮肤，剥离附着的肌肉组织，浸入至少20倍体积的4%多聚甲醛液中固定，置于4 ℃环境中保存。老龄小鼠股骨的扫描参数为：电压80 kV，电流115 μA，分辨率9 μm。选取远心端股骨生长板最低点0.15 mm厚度的骨质进行三维重建并使用工作站软件对感兴趣的区域(DOI)进行测量分析，分析指标包括：骨小梁相对骨体积(trabecular bone volume per tissue volume, Tb.BV/TV)，骨小梁数目(trabecular number, Tb.N)，骨小梁间隙(trabecular separation, Tb.Sp)，骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)，骨密度(bone mineral density, BMD)，皮质骨厚度(cortical thickness, Ct.Th)，骨外膜周长(periosteal perimeter, Ps.Pm)和骨内膜周长(endosteal perimeter, Es.Pm)。

2 结 果

2.1 Spermidine对老龄小鼠体重的影响 与Vehicle组相比，Spermidine干预全程不影响老龄小鼠的体重，差异无统计学意义(表1)。

表1 Spermidine对老龄小鼠体质量的影响

2.2 Spermidine对老龄小鼠骨代谢相关指标的影响 与Vehicle组相比，Spermidine干预全程不影响尿钙、尿磷和血磷水平，差异无统计学意义。但Spermidine干预可使老龄小鼠血钙与血ALP水平显著升高，差异有统计学意义(<0.05，表2)。

表2 Spermidine对老龄骨代谢相关指标的影响

2.3 Spermidine对老龄小鼠股骨微结构的影响 使用micro-CT对各组老龄小鼠股骨进行扫描重建(图1A)并对其微结构进行测量分析(图1B)，结果显示：与Vehicle组老龄小鼠相比，Spermidine干预明显提高老龄小鼠的Tb.BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD，差异均有统计学意义(<0.05)；显著降低老龄小鼠Tb.Sp(<0.05)；而对Ct.Th、Ps.Pm和Es.Pm无影响，差异无统计学意义。

A.股骨水平面三维重建；B.Tb.BV/TV, 骨小梁相对体积；Tb.N, 骨小梁数目；Tb.Sp, 骨小梁间隙；Tb.Th, 骨小梁厚度；BMD, 骨密度；Ct.Th, 皮质骨厚度；Ps.Pm, 骨外膜周长；Es.Pm, 骨内膜周长,与Vehicle组比较，①P<0.05图1 Spermidine对老龄小鼠股骨微结构的影响

3 讨 论

老龄性骨质疏松是一种衰老退行性疾病，骨形成和骨分解作用均降低，即骨转换率降低。本研究以老龄小鼠为研究对象，探讨Spermidine干预对老龄小鼠骨代谢和股骨微结构的影响，结果发现Spermidine可升高老龄小鼠血钙与血ALP水平，增加骨小梁的数目并提高骨小梁的质量。正常血钙、血磷浓度的维持在很大程度上依赖于血液与骨组织之间钙、磷的相互交换，血钙、血磷升高往往提示骨合成处于活跃状态，而尿钙、尿磷浓度升高则预示着骨分解作用增强。本研究发现，Spermidine干预能升高血钙水平，但对老龄鼠尿中钙和磷的水平均无影响，提示Spermidine能促进骨合成，但骨分解代谢无影响。骨合成初期，成骨细胞分泌的胶原纤维交织成网状。骨合成晚期，矿物盐沉积在胶原纤维网上形成矿物盐晶体。ALP可升高骨组织内矿物盐浓度，促进骨组织矿化。因此，血ALP水平升高提示新骨矿化活跃。本研究发现，Spermidine干预能提高老龄鼠血清中ALP的水平，这从另一个角度证实其能促进骨合成。骨代谢平衡的保持依赖于成骨细胞介导的骨形成作用和破骨细胞介导的骨分解作用，有研究显示，Spermidine和精胺组成的多胺混合物能通过抑制破骨细胞活性增加去卵巢小鼠的骨量，造成这些研究结果与本实验结果不同的原因可能是因为该研究使用了与本研究不同的实验动物模型。有研究表明，限制饮食导致的体重降低会伴随因钙、磷摄入不足引起的骨质量下降，本实验中Spermidine促进骨合成但并不影响老龄小鼠的体质量。

骨折是由于骨强度降低，骨组织抵抗骨折风险能力下降导致的结果，而骨强度又取决于骨组织矿物盐的含量和骨质量。在micro-CT结果中，BMD值可反应骨组织矿物盐的含量。本研究结果显示，Spermidine干预可提高老龄小鼠股骨BMD。骨质量的评价指标主要包括：Tb.BV/TV，Tb.N，Tb.Sp，Tb.Th，Ct.Th，Ps.Pm和Es.Pm等，其中Tb.Sp是预测老龄性骨折发生的关键指标，Tb.Sp增大与脆性骨折密切相关。本研究结果发现，Spermidine干预可降低老龄小鼠股骨的Tb.Sp，提高老龄小鼠股骨骨矿物盐的含量。但Spermidine干预对反应皮质骨质量的指标Ct.Th，Ps.Pm和Es.Pm均无影响，这可能是由于皮质骨比松质骨的骨转换率更低，对外界的刺激不敏感造成的。

综上所述，本研究发现Spermidine能够促进骨合成、缓解老龄小鼠的骨质疏松，因此提高老年人体内的Spermidine水平可能是治疗老龄性骨质疏松症的一种潜在治疗手段。目前治疗骨质疏松的双膦酸盐类和降钙素类药物主要是通过抑制骨分解发挥作用，对骨转换率低的骨质疏松治疗效果不佳。因此，通过促进骨合成发挥防治骨质疏松作用的药物可能更具有市场前景，还将进行更深入地研究。