决明子多糖的发酵工艺优化研究*

魏文凤，朱宗雨，裴婉琦，陈 香，刘自平

(安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088)

近年来，随着中草药的广泛运用于临床，报道的因中草药引发的各种各样的的不良反应也越来越多。决明子因被列为109种药食同源中药材之一而作为原料用于保健品长期服用，随之关于决明子保健品的负面影响的报道也日渐增多[1]。通过筛查，决明子中存在潜在风险的化学成分主要为蒽醌类[2]、植物甾醇和生物碱，而关于多糖的不良反应未见报道。

决明子又叫草决名，还瞳果，是一种豆科植物决明Cassia obtusifoliaL或小决明Cassia tora L的干燥种子[3]，决明子中含有多糖类、蒽醌类、萘骈吡喃酮类等成分。多糖既能抗氧化，调控免疫功能，降低血压血脂、改善胃肠道功能、保护肝脏和眼睛，同时对视神经也有一定的保护作用[4,5]，本课题拟通过乳酸菌[6]发酵法提高决明子中多糖含量。

1 仪器与试剂

SF-130C-万能粉粹机，山东精诚制造有限公司；SGSP-电热恒温隔水式培养箱，上海天美仪器有限公司；RE-3000立式压力蒸汽灭菌锅，济南生物技术有限公司；DZ30-32C6台式离心机，长沙离心机有限公司；UV1000紫外分光光度计，上海天美仪器公司；决明子，亳州市胜利饮片销售有限公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 决明子多糖的含量方法

2.1.1 供试品溶液的制备

称取10 g决明子粉末用石油醚脱脂，将挥干了石油醚的决明子粗粉与蒸馏水按体积比1:10混合，70 ℃下回流提取 30 min，无水乙醇常温静置24 h后，用离心机除去滤液，取沉淀，干燥除杂得到决明子多糖。称取决明子多糖10 mg在 100 mL容量瓶中定容至刻度线，得到浓度为0.1 mg/mL的溶液，即为供试品溶液。

2.1.2 标准溶液的制备

精密称取100 mg的葡萄糖，定容于1000 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

2.1.3 最大吸收波长的选择

量取1 mL葡萄糖标准溶液于10 mL试管中，加入15%的苯酚溶液1 mL，缓慢加入5 mL浓硫酸溶液混合后将其加热20 min，取出放置于温室下20 min放凉，加蒸馏水到 10 mL，以相同的方式对蒸馏水处理，记为空白对照组，按紫外分光光度法在450～550 nm波长区域内确定最大吸光度值，得出最大吸收波长为490 nm。

2.1.4 葡萄糖标准曲线的绘制

依次量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液,加蒸馏水至1 mL，向试管中各中加入15%的苯酚溶液1 mL，充分混合，缓慢滴入5 mL的浓硫酸，充分反应后加热20 min后，取出放置室温环境冷却20 min，以蒸馏水为空白对照组，测定吸光度值，回归方程为y=5.0685x-0.0052(R2=0.9996)。

图1 葡萄糖标准曲线

2.1.5 决明子多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[7]来测定多糖含量，量取1 mL供试品于试管中，加入15%的苯酚溶液1 mL混均，加入5.0 mL浓硫酸摇匀，加热20 min，然后冷却至室温测定吸光度。根据回归方程得到决明子多糖的浓度。计算决明子多糖含量从而计算多糖得率。公式如下：

决明子多糖得率=c×v×n/(1000m)×100%

式中：c为决明子多糖质量浓度(mg/mL)；v为提取液的总体积(mL)；n为稀释的倍数；m为决明子的质量(g)。

对供试品进行含量测定，得：

决明子多糖得率=c×v×n/(1000m)×100%=8.50%

2.2 发酵工艺优化

2.2.1 菌种活化

将奶粉兑水配制后，将乳酸菌加入其中，放置于恒温培养箱中37 ℃连续传代，在恒温培养箱中放置48 h。

2.2.2 培养基制备

将决明子进行除杂，粉粹，过400目筛备用。称取10 g决明子粉末与蒸馏水按体积比1:10混合，添加适量玉米粉做为氮源(15 g/L)，灭菌后分别调节pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。

2.3.3 接种

在超净工作台上用无菌吸量管吸取2 mL活化后的乳酸菌加入到三角瓶中。

2.3.4 发酵

2.3.4.1 单因素实验

(1)培养温度对决明子多糖得率的影响

选取pH为7.0的培养基接种乳酸菌后分别在35 ℃， 36 ℃，37 ℃，38 ℃，39 ℃的恒温培养箱中发酵48 h。发酵结束后取发酵液进行多糖提纯除杂，计算多糖得率。

由图2可知，当培养温度38 ℃时，决明子多糖得率逐渐上升达到峰值，然后决明子多糖提取率随着发酵温度的上升而下降。分析原因可能是温度升高，酶出现失活现象，导致多糖合成下降，故选择最适温度为38 ℃。

图2 温度对多糖发酵的影响

(2)发酵时间对决明子多糖得率的影响

选取pH为7.0的培养基接种乳酸菌在发酵温度为37 ℃时，发酵时间依次选择24 h、36 h、48 h、56 h、72 h。发酵结束后取发酵液进行多糖提纯除杂，计算多糖得率。

由图3可知，发酵时间在48 h之前决明子多糖的得率呈上升趋势，时间为48 h时达到顶峰，48 h后决明子多糖得率随着温度的升高而下降，可能是随着培养时间的延长，一方面代谢产物得积累，不利于多糖的合成，另一方面原料的消耗，促使乳酸菌以多糖为碳源，导致多糖含量下降，故培养时间为48 h时为最适时间。

图3 培养时间对多糖发酵的影响

(3)pH对决明子多糖发酵的影响

选取pH为5.0、6.0、7.0，8.0，9.0的培养基接种乳酸菌后在38 ℃的恒温培养箱中发酵48 h。发酵结束后取发酵液进行多糖提纯除杂，计算多糖得率。

由图4所示在pH为8.0之前决明子多糖得率呈上升趋势，在pH为8.0时达到顶峰，然后决明子多糖得率随着pH值得上升呈现下降趋势，分析原因可能是在pH为8.0时酶活性最大，故取pH为8.0为最适pH。

图4 pH对多糖发酵的影响

2.3.4.2 正交试验

根据单因素实验结果，考虑单因素之间的交叉作用，设计考察培养时间，培养温度，培养pH对多糖发酵的交互影响，选用L9(34)实验表进行实验，正交试验各因素水平参考表1，正交试验结果分析参考表2，方差分析结果参考表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验

表3 方差分析

F0.05(2,2)=19.0

由表1～表3可以看出，对决明子多糖发酵的影响因素大小以培养温度>培养时间>培养pH，决明子多糖提取最佳工艺条件组合A2B1C2，即培养pH为8.0，培养时间48 h，培养温度37 ℃的条件下决明子多糖经乳酸菌发酵后多糖得率最高。

3 结 论

将决明子作为碳源、玉米为氮源利用乳酸菌进行多糖发酵，考察培养温度、培养时间、培养pH对多糖得率的影响。结果当培养温度为37 ℃，培养时间为48 h，培养为pH 7.0时为多糖发酵最佳工艺，其多糖得率为11.85%，与决明子水提法相比多糖得率提高了39.4%。

本实验工艺简单，多糖得率高，可为开发利用决明子多糖进行食品、保健品、换妆品等产品的研发提供一定的理论依据和参考。