基于miR-370-3p与JAK2/STAT3通路相关性探讨活血荣络方促缺血性脑卒中后血管新生的机制

龚翠兰，杨仁义，周德生，凌 佳，傅馨莹，李俊熙

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学附属常德医院，湖南 常德 415000；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；4湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208)

缺血性脑卒中又称“脑梗死”，是临床常见脑血管病，占急性脑血管病的70%左右，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，给社会带来了严重的经济负担[1]。缺血性脑卒中后机体启动内源性血管新生保护机制，改善缺血区侧支循环和脑微循环，增加局部脑缺血区血流灌注，促进机体神经功能恢复。

前期研究提出，“荣气虚滞”是缺血性脑卒中的关键病机，荣气气化的“精化气-气生变-变成形”过程是缺血性脑卒中后血管新生的中医理论基础[2]，在活血荣络法指导下创立活血荣络方，纳入湖南中医药大学第一附属医院临床路径13年，具有滋阴养血、活血通络的功效，临床治疗缺血性脑卒中阴虚血瘀证颇有疗效[3]。同时，实验研究发现活血荣络方能增加脑缺血区微血管密度，促进血管新生，改善缺血性脑卒中后神经功能缺损症状[4]。因此，为进一步研究活血荣络方改善脑循环血管新生的作用机制，本研究以miR-370-3p介导JAK2/STAT3通路调控血管新生的机制为切入点，探讨活血荣络方治疗缺血性脑卒中的保护作用。

1 材料

1.1 动物10～12周SPF级雄性SD大鼠60只，体质量为(250～280)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004，饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心，实验许可证号：SYXK(湘)2015-0003，自由饮食，温度(25±2)℃，湿度45%～60%，昼夜均匀交替。适应性喂养7 d后进行实验，动物实验经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理批准号：20201010-8)。

1.2 药物与试剂

1.2.1药物 活血荣络方(湘药制字20080472)：鸡血藤30 g、石楠藤30 g、生地黄15 g、黄精15 g、玄参10 g、川芎10 g、乳香10 g、没药10 g。各药混合于置圆底烧瓶中，加10倍量水浸泡12 h后用冷凝回流装置加热回流2 h，提取第一次液过滤，残渣加8倍量水，继续冷凝回流1 h，提取第二次液过滤，合并两次过滤液于旋转蒸发仪上进行浓缩，即得活血荣络方浸膏，无菌玻璃瓶分装，4 ℃贮存备用。丁苯酞软胶囊(中国石药集团恩必普药业有限公司，批号：H20050299)。STAT3抑制剂Stattic(美国Selleck公司，批号：S7024)。

1.2.2主要试剂 MACO大鼠栓线(北京西浓，批号2636A4、2638A4)。EDTA(PH8.0)抗原修复液、自发荧光淬灭剂(中国Servicebio，批号分别为：G1206、G1221-2)；CD31、vWF荧光一抗(中国Servicebio，批号分别为：GB12063、GB11020)；VEGF荧光一抗(武汉三鹰，批号：19003-1-ap)；荧光二抗：488山羊抗兔、CY3-山羊抗小鼠、CY3荧光TSA(中国Servicebio，批号分别为GB25303、GB21301、G1223)；DAPI(中国Servicebio，批号：G1012)。SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(中国康为世纪生物，批号：CW0022S)；Immobilon Western HRP底物(美国Millipore，批号：WBKLS0100)；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗体(英国Abcam，批号分别为ab108596、ab32101、ab68153、ab76315)；β-Actin(美国Proteintech，批号：20536-1-AP)；Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(英国Abcam，批号：ab150120)。RNA提取试剂盒，RT First Strand cDNA Synthesis Kit，2×SYBR Green qPCR Master Mix (中国Servicebio，批号分别为G3013、G3330、G3322)；HyPure TMMolecular Biology Grade Water(美国HyClone，批号SH30538.02)。

1.3 主要仪器石蜡切片机(美国Thermo Scientific)；显微成像系统(中国Motic)；Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽、Mini Trans-Blot型转印槽、PowerPac Basic基础电泳仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；台式高速冷冻型微量离心机(中国DragonLab)；超微量分光光度计(美国Thermo Scientific)；多功能酶标仪(美国Perkinelmer)；正置荧光显微镜(日本尼康)。

2 方法

2.1 大鼠脑缺血/再灌注模型的制备大鼠适应性喂养7 d后，10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉满意后，参考Longa等[5]报道的大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，从距ECA与ICA分叉部约4 mm处斜45°剪口进拴线，插入拴线约18 mm梗阻右侧大脑中动脉；梗阻2 h后拔出拴线进行再灌注，以建立局灶性脑缺血/再灌注大鼠(middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCAO/R)模型。

2.2 动物分组与给药将60只SD大鼠随机分成假手术组10只，造模组分别为模型组、活血荣络方组、丁苯酞组、Stattic组、活血荣络方+ Stattic组(联用组)，每组各10只。假手术组分离CCA、ECA、ICA，不插入拴线，余操作与造模组相同，造模组予以MCAO/R法造模。实验过程中出现死亡、取材时发现蛛网膜下腔出血或脑出血剔除，根据需要予以补充。

手术6 h后对大鼠进行灌胃给药，药物剂量及时间参照前期实验研究及药物说明书。活血荣络方组、联合组予以活血荣络方药液(11.7 g·kg-1)，丁苯酞组予以丁苯酞混悬液(6 mg·kg-1)，假手术组、模型组、Stattic组予以等体积的生理盐水，每日固定时间点灌胃给药1次；Stattic组、联合组予以Stattic工作液(3.75 mg·kg-1)，假手术组、模型组、活血荣络方组、丁苯酞组予以等体积生理盐水，每日固定时间点灌胃给药1次，各组大鼠连续给药7 d后，进行指标检测。

2.3 神经功能缺损评分评价神经功能缺损程度各组大鼠分别于d 1、3、7按Zea-Longa′s评分法[5]进行神经功能缺损评分，标准如下：0 =无障碍；1=不能完全伸展对侧前肢；2=向对侧转圈；3=向对侧倾倒，站立不稳；4=无自主活动、意识障碍、不能自发行走。分值越高提示神经功能缺损越严重。

2.4 免疫荧光染色观察脑组织皮质区CD31、vWF、VEGF表达采用免疫荧光染色法检测脑组织CD31、vWF、VEGF表达，以CD31与vWF双染阳性细胞计算微血管密度，同时检测VEGF表达，测定平均荧光强度。石蜡切片脱蜡至水后，置于EDTA抗原修复缓冲液中，放置于微波炉内，中火8 min停火8 min转中低火7 min，进行抗原修复，自然冷却后置于PBS中脱色。然后BSA孵育30 min封闭后，将切片与1 ∶200抗CD31、1 ∶200抗vWF和1 ∶3 000抗VEGF在4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后，加与一抗相应种属的二抗，避光室温孵育50 min，洗涤后加DAPI染液，避光室温孵育10 min，洗涤后用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察并采集图像，采用ImageJ随机在镜下取5个视野，对5个视野中CD31与vWF双染阳性细胞计数，取5个视野均数，计算微血管密度；同时采用ImageJ测定脑组织中VEGF平均荧光强度。

2.5 Western blot法检测脑组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达采用Western blot法检测脑组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达。取梗死侧脑组织于冰上，加入裂解液(组织裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)后，经组织捣碎匀浆机充分研磨提取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度。蛋白上样量为3 g·L-1，10 μL/孔。经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，JAK2、STAT3用5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，p-JAK2、p-STAT3用5%BSA封闭1.5 h，一抗JAK2(1 ∶2 000)，p-JAK2(1 ∶2 000)，STAT3(1 ∶2 000)，p-STAT3(1 ∶2 000)4 ℃孵育过夜，洗膜3次，10 min/次，二抗(山羊抗兔，1 ∶10 000)37 ℃恒温水浴摇床孵育60 min，再次洗膜后显色成像。使用ImageJ分析图像灰度值，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示蛋白相对表达量。

2.6 Real-time PCR法检测脑组织JAK2、STAT3 mRNA及miR-370-3p的表达采用Real-time PCR(RT-PCR)法检测各组大鼠脑组织中JAK2、STAT3 mRNA与miR-370-3p的表达。取液氮冻存后的脑组织100 mg，用1 mL的TRIzol Reagent提取脑组织总RNA，使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度。采用RT First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒进行逆转录，按照试剂盒说明书进行扩增。反应体系为：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol·L-1基因引物1.5 μL，反转录产物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。预变性95 ℃，10 min，循环(40次)95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，熔解曲线60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。mRNA以GAPDH为内参；miRNA以U6为内参，相对表达量用2-ΔΔCt对进行分析，引物序列见Tab 1。

Tab 1 PCR primer sequence

2.7 Pearson相关性分析脑组织miR-370-3p与JAK2/STAT3通路的相关性根据模型组、活血荣络方组、丁苯酞组、Stattic组、联用组大鼠的miR-370-3p与JAK2、STAT3 mRNA表达值，采用SPSS 23.0软件进行Pearson相关性分析，并通过R语言绘制miR-370-3p与JAK2、STAT3的相关系数图。当P<0.05时，则两变量存在相关性；R>0时为正相关，R<0为负相关；0≤|R|<0.3为低度相关，0.3≤|R|<0.5为中度相关，0.5≤|R|<1为高度相关；|R|越大，相关性越大。

2.8 LncRNA-H19靶向miR-370-3p调节JAK2/STAT3信号通路培养大鼠脑血管平滑肌细胞，对照组正常培养，TNF-α组的细胞用100 μg·L-1TNF-α处理；将si-NC、si-H19、miR-NC、miR-370-3p mimics转染至TNF-α诱导的大鼠脑血管平滑肌细胞，分别记为TNF-α+si-NC组、TNF-α+si-H19组、TNF-α+miR-NC组、TNF-α+miR-370-3p组；将si-H19和anti-miR-NC、si-H19和miR-370-3p共转染至TNF-α诱导的大鼠脑血管平滑肌细胞，记为TNF-α+si-H19+anti-miR-NC组、TNF-α+si-H19+anti-miR-370-3p组。RT-qPCR检测LncRNA-H19和miR-370-3p表达水平；荧光素酶报告实验检测LncRNA-H19和miR-370-3p的靶向关系。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分Zea-Longa′s评分越高，神经功能缺损越严重，其结果显示，与假手术组比较，1 d、3 d、7 d神经功能缺损评分模型组明显升高(P<0.01)。与模型组比较，活血荣络方组与丁苯酞组1 d评分无明显变化(P>0.05)，3 d评分降低(P<0.05)，7 d评分明显下降(P<0.01)；Stattic组1 d、3 d、7 d评分均无明显变化(P>0.05)；联用组1 d、3 d评分无明显变化(P>0.05)，7 d评分明显降低(P<0.01)。与活血荣络方组比较，丁苯酞组1 d、3 d、7 d评分均无明显变化(P>0.05)；Stattic组1 d评分无明显变化(P>0.05)，3 d、7 d评分明显升高(P<0.01)；联用组1 d、3 d评分均无明显变化(P>0.05)，7 d评分升高(P<0.01)；与Stattic组比较，联用组1 d评分无明显变化(P>0.05)，3 d评分降低(P<0.05)，7 d评分明显降低(P<0.01)，见Tab 2。

Tab 2 The neurological deficit score of rats

3.2 各组大鼠脑组织皮质区CD31、vWF及VEGF表达大鼠脑组织免疫荧光结果显示，以CD31和vWF共表达阳性细胞作为新生血管，计算MVD，结果显示，与假手术组比较，模型组MVD明显升高(P<0.01)。与模型组比较，活血荣络方组、丁苯酞组、联用组MVD明显升高(P<0.01)，Stattic组降低(P<0.05)。与活血荣络方组比较，丁苯酞组无明显变化(P>0.05)，Stattic组与联用组明显降低(P<0.01)。与Stattic组比较，联用组明显升高(P<0.01)。VEGF免疫荧光平均荧光强度结果显示，与假手术组比较，模型组明显升高。与模型组比较，活血荣络方组、丁苯酞组明显升高(P<0.01)，Stattic组明显降低(P<0.01)，联用组无明显变化(P>0.05)。与活血荣络方组比较，丁苯酞组无明显变化(P>0.05)，Stattic组明显降低(P<0.01)，联用组降低(P<0.05)。与Stattic组比较，联用组明显升高(P<0.01)。免疫荧光图谱见Fig 1、Fig 2，MVD与VEGF平均荧光强度结果见Fig 3。

3.3 各组大鼠脑组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3明显升高(P<0.01)。与模型组比较，活血荣络方组JAK2、p-JAK2、p-STAT3明显升高(P<0.01)，STAT3升高(P<0.05)；丁苯酞组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3明显升高(P<0.01)；Stattic组p-JAK2、STAT3、p-STAT3明显降低(P<0.01)，JAK2降低(P<0.05)；联用组JAK2、p-JAK2、p-STAT3无明显变化(P>0.05)，STAT3明显降低(P<0.01)。与活血荣络方组比较，丁苯酞组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3无明显变化(P>0.05)；Stattic组与联用组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3均明显降低(P<0.01)。与Stattic组比较，联用组p-JAK2、STAT3、p-STAT3明显升高(P<0.01)，JAK2升高(P<0.05)，见Fig 4。

Fig 1 Double immunofluorescence staining of CD31 and vWF in brain tissue of rats in each groupA:Sham operation；B：Model；C:Huoxue rongluo prescription；D:Butylphthalide；E:Stattic；F:Combination

Fig 2 Immunofluorescence staining of VEGF in brain tissue of rats in each groupA:Sham operation；B:Model；C:Huoxue rongluo prescription；D:Butylphthalide；E:Stattic；F:Combination

Fig 3 Mean fluorescence intensity of MVD and VEGF in cerebral cortex of A:Sham operation；B:Model；C:Huoxue rongluo prescription；D:Butylphthalide；E:Stattic；F:Combination.**P<0.01 vs Sham operation；#P<0.05，##P<0.01 vs Model；&&P<0.01 vs Huoxue rongluo prescription;△△P<0.01 vs Stattic

3.4 各组大鼠脑组织JAK2、STAT3 mRNA及miR-370-3p的表达RT-PCR结果显示，与假手术组比较，模型组JAK2、STAT3 mRNA及miR-370-3p均明显升高。与模型组比较，活血荣络方组、丁苯酞组JAK2、STAT3 mRNA均明显升高(P<0.01)，miR-370-3p明显降低(P<0.01)；Stattic组JAK2 mRNA、miR-370-3p无明显变化(P>0.05)，STAT3 mRNA明显降低(P<0.01)；联用组JAK2 mRNA均明显升高(P<0.01)，STAT3 mRNA与miR-370-3p明显降低(P<0.01)。与活血荣络方组比较，Stattic组JAK2、STAT3 mRNA明显降低(P<0.01)，miR-370-3p明显升高(P<0.01)；联用组JAK2、STAT3 mRNA明显降低(P<0.01)，miR-370-3p无明显变化(P>0.05)。与Stattic组比较，联用组JAK2、STAT3 mRNA明显升高(P<0.01)，miR-370-3p明显降低(P<0.01)，见Fig 5。

Fig 4 Relative expression values of JAK2，p-jak2，STAT3 and p-STAT3 proteins in brain tissue of rats in each groupA.Sham operation；B.Model；C.Huoxue rongluo prescription；D.Butylphthalide；E.Stattic；F.Combination.**P<0.01 vs Sham operation；##P<0.01，#P<0.05 vs Model；&P<0.05，&&P<0.01 vs Huoxue rongluo prescription；△△P<0.01，△P<0.05 vs Stattic

Fig 5 Expression of JAK2，STAT3 mRNA and mir-370-3p in brain tissue of rats in each groupA：Sham operation；B：Model；C：Huoxue rongluo prescription；D：Butylphthalide；E：Stattic；F：Combination.**P<0.01 vs Sham operation；##P<0.01 vs Model；&&P<0.01 vs Huoxue rongluo prescription；△△P<0.01 vs Stattic

3.5 大鼠脑组织miR-370-3p与JAK2、STAT3的相关性Pearson相关性分析结果显示，miR-370-3p与JAK2、STAT3高度负相关，相关系数分别为-0.92、-0.53；JAK2与STAT3高度正相关，相关系数为0.64，见Fig 6。

Fig 6 Correlation coefficient of mir-370-3p with JAK2 and STAT3

3.6 LncRNA-H19和miR-370-3p在TNF-α诱导的大鼠脑血管平滑肌细胞中的表达与对照组比较，LncRNA-H19在TNF-α诱导的大鼠脑血管平滑肌细胞中的表达水平明显升高，miR-370-3p在TNF-α诱导的大鼠脑血管平滑肌细胞中的表达水平明显降低(P<0.05)，见Tab 3。

Tab 3 TNF-α of lncRNA-h19 and miR-370-3p expression level of brain vascular smooth muscle cells induced by TNF-α

3.7 LncRNA-H19和miR-370-3p的靶向调控关系双荧光素酶报告实验结果显示，TNF-α+miR-370-3p组与TNF-α+miR-NC组比较，WT-H19荧光素酶活性差异具有明显性(P<0.05)，MUT-H19荧光素酶活性差异无明显性(P>0.05)，见Tab 4、Fig 7。

Fig 7 The targeted regulatory relationship between lncRNA-H19 and miR-370-3p

Tab 4 Double luciferase report

4 讨论

缺血性脑卒中发生后，机体可启动内源性血管新生系统，改善脑侧支循环，增加脑血流灌注，为局部缺血区供氧及营养物质，以挽救脑组织缺血缺氧状态，加快神经功能恢复。

STAT/HIF-1α/VEGF通路是缺血性脑卒中后血管新生的关键通路，缺血性脑卒中发生后，IL-6、TNF等多种炎症因子、细胞因子与细胞膜上受体结合后，通过磷酸化的方式激活JAK2/STAT3通路，在细胞核内形成同源或异源STAT3二聚体，易位入核，促进核内HIF-1α转录，使得HIF-1α下游VEGF转录进一步激活，介导下游PI3K-AKT通路、PLCγ1-PKC通路、MAPK通路[6]，促进内皮细胞(ECs)增殖、迁移、分化成管，调控Rho家族蛋白促进血管伪足形成，在多种疾病血管新生中发挥重要作用[7]。miRNA能特异性识别下游目的基因mRNA 3′UTR，抑制下游基因表达，参与调控血管新生的进程[8]。Stattic是非肽类STAT3 SH2结构域抑制剂，能有效抑制STAT3激活和核易位，Xue等[9]研究发现，JAK2/STAT3通路抑制剂Stattic抑制ECs增殖，下调了VEGFA/B、VEGFR2的表达，抑制血管新生。

团队前期研究发现，“阴虚血瘀—荣气虚滞”理论立方的活血荣络方在缺血性脑卒中早期能调控JAK2/STAT3通路，降低IL-1β、TNF-α、MMP-9的表达，减轻脑缺血再灌注后炎症损伤[10]；在缺血性脑卒中后期能促进Caveolin-1蛋白表达，增加梗死区微血管密度，促进脑梗死后血管新生；其有效成分可能通过 STAT3/miRNA 反馈环路激活 STAT/HIF-1/VEGF 信号通路促脑梗死后血管新生[11]，为中医药治疗脑梗死疾病提出了深层次的分子机制及新的方向。前期检索Targetscan数据库发现，STAT3的转录后翻译过程受10位上游miRNA的调控，根据预测分数及权重分数可知，排列前三位的是miR-370-3p、miR-290、miR-292-5p(预测分数均达85)，因此推测缺血性脑卒中的发生机制可能与miR-370-3p调控JAK2/STAT3通路有关，且活血荣络方可能参与此机制促进缺血性脑卒中后期血管新生。

CD31与vWF是ECs的特异性标志蛋白，大鼠脑组织免疫荧光染色后CD31、vWF和DAPI分别呈现红色、绿色和蓝色，CD31与vWF共表达的阳性细胞作为新生血管，计算微血管密度，结果显示活血荣络方能明显促进缺血性脑卒中大鼠血管新生及脑组织中VEGF的表达，Stattic能明显抑制缺血性脑卒中大鼠血管新生及脑组织中VEGF的表达。提示在大鼠缺血性脑卒中后，机体内源性血管新生启动，活血荣络方可能有促进作用，而Stattic作为特异性STAT3抑制剂，在一定程度上可能抑制了内源性血管新生的启动。

LncRNAH19为父系印记基因，位于人类染色体11p15.5的端粒区域附近的H19/IGF2基因簇上，该区域常涉及儿童和成人肿瘤。研究发现，lncRNA H19可作为ceRNA竞争结合DUSP5，并解除DUSP5对其靶基因Erk1/2的抑制，即通过lncRNA H19/DUSP5/Erk1/2调控轴激活自噬过程从而诱导脑IRI[12]；miR-370-3p是一个肿瘤相关miRNA,可调控细胞增殖、凋亡及侵袭等生理过程，抑制脑胶质瘤、膀胱癌细胞的侵袭。Cui等[13]研究表明，miR-370-3p参与下丘脑的慢性电针耐受过程，过表达miR-370-3p可降低电针耐受，提示miR-370-3p可能具有神经生理调节能力,可能作为一种靶点干预抑郁症。另外，经过TargetScan3.1软件预测miR-370-3p可能与lncRNA H19存在靶向关系,双荧光素酶报告验证lncRNA H19是miR-370-3p靶向调控分子。

Western blot、RT-PCR及Pearson相关性分析结果显示JAK2与STAT3呈高度正相关，二者与miR-370-3p呈高度负相关；活血荣络方能上调JAK2、STAT3 mRNA表达，也能促进JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达；而Stattic能下调STAT3 mRNA表达，且能抑制JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达，提示活血荣络方与丁苯酞能下调miR-370-3p的表达，激活JAK2/STAT3通路；Stattic在不影响miR-370-3p的表达的条件下，可能通过磷酸化途径抑制JAK2/STAT3通路。Ruan等[14]研究发现，miR-370在MCAO大鼠脑组织中过表达，能靶向抑制SIRT6表达，激活Nrf2/ARE通路，加重神经功能缺损。Zhang等[15]研究发现，激活STAT3能上调VEGF的表达，此过程能被Stattic逆转，与Carbajo等[16]报道的Stattic阻断HIF-1α/STAT3通路，抑制VEGF表达，抗血管新生的结果相互佐证。Li等[17]研究发现，丁苯酞能激活JAK2/STAT3通路，减轻海马神经元细胞凋亡，改善脑缺血损伤。

同时，TNF-α+si-H19组和TNF-α+si-H19+anti-miR-370-3p组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显升高。提示活血荣络方可能下调miR-370-3p的表达及lncRNA H19靶向激活JAK2/STAT3通路，从而促进VEGF表达并刺激血管新生，改善大鼠缺血性脑卒中后神经功能症状。

综上所述，活血荣络方治疗缺血性脑卒中的机制可能与其下调miR-370-3p的表达，激活JAK2/STAT3通路，促进下游VEGF的表达，刺激缺血性脑卒中后血管新生，改善神经功能缺损症状有关，为进一步中医药防治缺血性脑卒中提供了实验基础。