青岛市雾天细菌气溶胶群落结构特征及健康风险❋

张 婷， 王太恒， 祁建华， 李先国， 张大海❋❋

(1. 中国海洋大学化学化工学院， 山东 青岛 266100； 2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室， 山东 青岛 266100)

近年来，中国经济迅猛发展，随之而来的副产物——雾霾，频繁覆盖全国各大城市，且多以“组合”的形式出现在大众视野[1]。一方面虽然雾、霾产生的机理不同，但都伴随着能见度低、风速小、相对湿度高的特点。另一方面，均与大气气溶胶有密不可分的联系[2]，并且特定时间段内，随着相对湿度的变化，二者可以相互转化[3]。Meng等[4]研究发现，雾滴可以促进细颗粒物在近地表层的积累，进而影响其时空分布。

霾又称灰霾和阴霾，其中PM2.5是霾发生的主要原因[5]，雾霾天气下生物气溶胶群落结构特征已经有很多相关报道[6-7]。Wei等[8]利用紫外空气动力学粒子光谱仪检测雾霾环境下大气生物气溶胶，发现雾霾天气下荧光粒子浓度是晴天的6倍以上，同时雾霾环境下生物气溶胶中具有更多的致敏和致病性微生物。生物气溶胶受雾霾天气影响显著，同时也有研究发现，生物气溶胶的群落结构表现出明显的季节变化。Du等[9]发现，北京市雾霾期间生物气溶胶群落结构与污染水平没有明显的相关性，主要是由季节变化驱动。在天气监测与研究中，雾和霾是两种不同的天气现象[10]。雾是一种低层云，作为一种灾害性自然现象，会对交通运输、农业生产和公共生活造成影响。雾天相对湿度高、光照较弱，不益于人们进行室外活动，容易造成胸闷、气短和注意力不集中等不良反应。但是微生物在这种生存条件下可以保持良好的活性及代谢能力[11]。霾是空气中颗粒物增多，导致能见度降低的大气污染现象[12]。霾天细颗粒物增多，为微生物提供了附着、传播的载体，同时大气中金属离子、有机化合物(例如多环芳烃)和硝基衍生物等浓度发生显著波动，某些成分对微生物的生存具有毒性作用，从而导致耐性差的物种消失[13]。简而言之，以雾霾或颗粒物水平进行研究，会导致雾天生物气溶胶的群落特征认知模糊，健康风险被忽视。由于雾、霾本质上的差异，应该在研究中对二者进行严格地区分。

本研究排除采样时间跨度带来的影响，同时基于雾和霾本质上的差异，采集青岛市2020年7—9月空气质量指数(Air Quality Index,AQI)小于100且不同相对湿度下的生物气溶胶样品。分析雾天与晴天环境下细菌群落结构差异，结合BugBase细菌功能预测和人间传染微生物的研究结果，评估了高相对湿度下生物气溶胶给人体带来的健康风险。

1 材料和方法

1.1 采样时间及地点

采样地点位于中国海洋大学崂山校区气象观测站(36°10′N, 120°30′E)(见图1)。于2020年7—9月采集不同相对湿度生物气溶胶样品，按AQI<100，相对湿度90.00%为标准[14]分为2个雾天(F1、F2)和2个晴天样本(S1、S2)。

图1 采样位置

1.2 采样方法

采用KC-1000型大流量TSP采样器(青岛崂山电子仪器总厂有限公司)采集生物气溶胶样品，流量1 m3·min-1，采样时间24 h，采样膜采用石英纤维滤膜，采样前用马弗炉500 ℃灼烧4 h，采样后用无菌锡箔纸包裹，放置在超低温冰箱内保存。气象数据来源于青岛市气象局(http://qdqx.qingdao.gov.cn/)，颗粒物和气体污染物浓度来源于青岛市环境保护局资料(http://www.qepb.gov.cn/m2/index.aspx)(见表1)。

表1 采样期间气象参数、颗粒物及气体污染物浓度

1.3 DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[15]对样本的基因组DNA进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释。以稀释后的基因组DNA作为聚合酶链式(PCR)反应模板，对16SrRNA基因的V4-V5区域进行扩增。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库，经过量子(Qubit)和定量聚合酶链式反应(Q-PCR)定量。文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样本的测序读段(Reads)进行拼接、过滤和去除嵌合体的处理，得到最终的有效数据(Effective Tags)。利用Uparse软件对所有样本的全部有效数据进行聚类，默认以97.00%的一致性将序列聚类成为可操作分类单元(OTU)，根据OTUs序列进行物种注释[16]。

1.4 功能注释

利用BugBase[17]对细菌进行功能注释，以97.00%的一致性将序列聚类成为的OTU表作为输入文件。首先通过预测的16S拷贝>数对OTU表进行标准化处理，然后使用预先处理好的数据库和BugBase工具自动选择的阈值来预测微生物表型。分为以下七类：革兰氏阳性、革兰氏阴性、生物膜形成、致病性、移动元件、氧需求(好氧型、厌氧型和兼性厌氧型)及氧化胁迫耐受。

2 结果与讨论

2.1 Alpha多样性分析

两组样品经拼接、质控和去嵌合体后共得到有效数据124 466条，以97.00%的一致性聚类为352个OTU，注释到34门、58纲、118目、163科、201属和91种。两组样品覆盖率均为1，说明测序深度已达到要求，样品具有代表性。样品韦恩图(见图2)显示，雾天总OTUs数值为237、独有OTUs数值为58，晴天总OTUs数值为294、独有OTUs数值为115，均高于晴天。Dong等[18]研究发现，雾天微生物的浓度为9.00×105cells·m-3，涨幅约为晴天的37.00%，采样期间雾天PM2.5浓度为76.50μg·m-3，晴天为52.20μg·m-3，而本研究采样期间雾天AQI，PM2.5和PM10等污染物浓度均低于晴天(见表1)，颗粒物污染可能是导致研究结果相反的重要原因，说明本研究排除了类似霾天的颗粒物污染。

图2 样本韦恩图

霾天细菌气溶胶相关研究发现，霾发生时微生物总数增加[19]，不同天气下微生物总数呈现：霾天>晴天>雾天。两组样品共有OTUs数为179，说明这些物种具有较强的适应能力，可以在不同天气条件下稳定生存。随着相对湿度的升高，样品中OTUs呈现先下降后上升再下降的趋势。当相对湿度开始升高时，一些细菌物种不能适应环境的改变而消失，OTUs降低；当相对湿度高达90%(雾天)以上时，一些适应高相对湿度环境的物种变多，OTUs升高；但当相对湿度高达99%时，此时的生存环境对于微生物是比较苛刻的，导致OTUs再次下降。

晴天香农指数(3.63)、辛普森指数(0.72)、Chao1指数(222.01)均大于雾天(香农指数(2.73)、辛普森指数(0.55)、Chao1指数(216.39))，说明晴天样品的生物多样性、丰富度和均匀度更高，这与霾天物种多样性的变化趋势相同。雾、霾天气发生时，生物多样性呈下降趋势。相关研究表明，相对湿度与微生物多样性呈显著负相关[9,20]，解释了雾天生物多样性的下降。雾天时，一些细菌不能适应生存条件的改变而大规模消失，与此同时适应雾天环境的物种增加，组内亲缘指数上升(雾天：26.115、晴天：19.611)，说明雾天样品的组内亲缘关系更复杂，晴天两个样本群落结构更加相似，F2采样期间相对湿度高达99%，与另一个样品区别较大，说明相对湿度越高，生物多样性变化幅度越大。

2.2 细菌群落结构

由前十门相对丰度图(见图3(a))可知，前十门相对丰度差别较大，变形菌门占主导地位，具有绝对优势，是雾天和晴天样品的优势菌门，雾天相对丰度为79.48%、晴天相对丰度为69.67%。斯皮尔曼相关性分析(见图4(a))显示，变形菌门与气象因子并没有明显的相关性。相关研究表明，变形菌门是细菌中最大门类，也是不同地区，不同生物气溶胶样本中优势菌门[21-22]。其次是放线菌门(雾天11.72%、晴天13.91%)和厚壁菌门(雾天2.67%、晴天3.80%)。霾天相关研究发现，变形菌门与厚壁菌门相对丰度差别不大[23-24]。然而本研究中二者相对丰度相差极大，变形菌门的相对丰度是厚壁菌门的20倍，采样时平均相对湿度高达87%，同时厚壁菌门在雾天的相对丰度小于晴天，说明变形菌门受相对湿度变化影响较小，但厚壁菌门影响较大。当雾发生时蓝细菌门和脱硫菌门相对丰度明显降低(蓝细菌门：晴天5.38%、雾天0.55%；脱硫菌门：晴天相对0.17%、雾天小于0.01%)。由图4(a)可以看出，以上两个细菌门与相对湿度呈负相关，说明蓝细菌门与脱硫菌门不适应高湿度的生存环境，相对湿度增加，两种门类的一些菌种消失。拟杆菌门、绿弯菌门、酸杆菌门等在两组样品中差别不大，说明以上几种菌门对环境的耐性较好，受环境影响较小。

由前十属相对丰度图(见图3(b))可以看出，罗尔斯通氏菌在两组样品中相对丰度均超过50%(雾天64.29%、晴天51.28%)，是两组样品的绝对优势菌属。罗尔斯通氏菌又名青枯菌，是一种已知的植物病原体，被称为植物“癌症”，会造成农作物减产[25]，属水平相关性分析热图(见图4(b))。图4(b)显示，罗尔斯通氏菌属与O3呈正相关，采样时雾天O3平均浓度高于晴天，因此相对湿度高的环境下需要对农作物进行青枯病的防治。除罗尔斯通氏菌属外，其他菌属相对丰度较为均匀，丙酸菌(7.89%)和副球菌(4.39%)是晴天优势菌属(相对丰度>2%)，短杆菌(4.33%)、丙酸菌(2.91%)和短波单胞菌(2.10%)是雾天优势菌属。丙酸菌是皮肤病原菌，暴露于高浓度的丙酸杆菌，会引起面部以及躯干皮肤疾病[26]，丙酸菌与NO2呈正相关与相对湿度呈负相关，副球菌属与温度呈负相关，因此以上两种菌属在晴天相对丰度较高。短杆菌属与温度呈现正相关，不动杆菌属与NO2呈现负相关，因此两种菌属在雾天相对丰度较高。

图3 不同天气下物种相对丰度图

图4 Spearman相关性分析热图

通过实验结果发现：雾天微生物几乎来源于本土，这一点与霾天相关研究有很大区别。霾天颗粒物增多，会带来颗粒物源区的微生物菌属[27-29]，同时不同地区研究发现，霾发生时微生物群落变化较大，且优势菌属具有很大差异[30]。但是雾天相对湿度高，不利于微生物的扩散和释放[31]，出现新物种的概率较低，与晴天的细菌在属水平上差异性较小，只是相对丰度有所不同。

2.3 基因功能注释及健康风险

生物气溶胶是微生物病原体(内毒素、过敏原)的已知来源[32]，会对人类及动植物的健康造成不良影响[33-36]。国内外对于生物气溶胶健康风险的评估方式大体分为四种：动物实验、沉积动力学、大数据和平均日暴露剂量率模型推算。其中最常用的还是1999年美国环境保护署提出的平均日剂量率(ADD)模型[37]，但可培养类微生物在空气中微生物总数的占比不到1%，随着高通量技术的发展，基因功能预测开始被应用于环境样本的研究中。

由BugBase预测的细菌7种表型丰度图(见图5)可以看出，两种天气中好氧细菌相对丰度高达85%以上，晴天好氧细菌比雾天相对丰度高(晴天93.64%、雾天84.75%)，同时雾天厌氧细菌占比高于晴天(雾天0.80%、晴天0.47%)。雾天相对湿度高，空气中聚集大量水珠，使气溶胶粒子散射吸湿增长、消光特性增强[38]，从而导致雾天紫外线照射空气透过率低，植物光合作用不充分，氧气含量低于晴天。氧气含量的降低使得一些对氧气需求比较大的好氧型细菌物种消失，导致其丰度低于晴天。两组样品中兼性厌氧型细菌相差不大，相对丰度约为4%。雾天样品中移动原件型细菌相对丰度70.13%，高于晴天样品(56.55%)，移动原件型细菌可以使细菌进行表型进化，从而最大限度地获得和适应环境，并生存繁殖出所必须的功能，雾天相对丰度高是因为一部分细菌进行了表型的进化，适应了高相对湿度的环境。两种天气中革兰氏阴性菌占比均高于阳性菌，丰度相差不大。革兰氏阴性菌相对丰度为85%左右，革兰氏阳性菌相对丰度为13%左右。常见的蓝细菌和大多数致病性芽孢杆菌均呈现革兰氏阴性反应，如：伤寒杆菌、百日咳杆菌、霍乱杆菌等。相关研究表明，革兰氏阴性菌细胞壁外层特有的结构——内毒素[39]，作为外源性致热源会影响体温调节中枢，引起宿主发热、发炎，同时很容易附着在颗粒上造成肺扩散能力降低[40-41]。葡萄球菌、肺炎双球菌、破伤风等致病菌呈革兰氏阳性反应，产生外毒素从而感染疾病。雾天潜在性致病菌相对丰度高达73.42%，高于晴天(59.95%)，雾天生物气溶胶中的致病性细菌更多，给人体带来的健康风险更大。

图5 微生物预测表型丰度图

两种天气条件下均检测出棒状杆菌、沙雷氏菌、葡萄球菌、奈瑟菌、不动杆菌和摩根氏菌6种人间传染致病性微生物，雾天总相对丰度为6.51%，晴天为4.42%。其中棒状杆菌、沙雷氏菌和葡萄球菌在两种天气下相对丰度相差不大，梭状芽孢杆菌是棒状杆菌属中最需要关注的菌种，是引起传染性疾病——白喉的病原体[42]。沙雷氏菌和不动杆菌广泛分布于环境中，属于条件性致病菌和医院获得性病原体，粘质沙雷氏菌会引发术后病人败血症，鲍曼不动杆菌会引起肺炎、心内膜炎、皮肤和软组织感染及脑膜炎等。葡萄球菌分为两大类：金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌是社区和医院获得性感染的主要原因之一，会引起浅表脓肿和伤口感染、深部和全身性感染，例如骨髓炎和中毒性休克综合征等疾病，在非金黄色葡萄球菌中，表皮葡萄球菌会造成导管的相关感染[43]。奈瑟菌在晴天含量较高(1.63%)，雾天相对丰度小于0.01%。不动杆菌以及摩根氏菌在雾天相对丰度较高(>1.5%)，晴天相对丰度小于0.01%，致病性奈瑟氏菌(淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌)具有改变表面结构从而在人类黏膜组织上定殖的能力，进而导致淋病和流行性脑膜炎[44]。摩根氏菌常见于粪便中，是一种机会性致病菌。两种天气下潜在病原体与人间传染微生物相对丰度变化结果表明，雾天致病性以及传染性菌种更为丰富，需要更加引起关注。

3 结论

(1) 雾天OTUs、物种多样性及丰富度均低于晴天，组内亲缘复杂度高于晴天。相对湿度越高，物种多样性变化幅度越大。罗尔斯通氏菌、短杆菌、丙酸菌和短波单胞菌是雾天优势菌属。雾天微生物几乎来源于本土，与晴天存在的细菌属水平上几乎相同，只是相对丰度上有一定差异性。

(2) 革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌在两组样品中差别不大，雾天潜在致病性细菌相对丰度(73.42%)高于晴天(59.95%)。两种天气条件下均检测出棒状杆菌、沙雷氏菌、葡萄球菌、奈瑟菌、不动杆菌和摩根氏菌6种人间传染致病性微生物，雾天总相对丰度为6.51%，晴天为4.42%。其中棒状杆菌、沙雷氏菌和葡萄球菌在两种天气下相对丰度相差不大，奈瑟菌在晴天含量较高，不动杆菌和摩根氏菌在雾天相对丰度较高。

(3) 结合潜在病原体和人间传染微生物分析，结果表明雾天生物气溶胶给人体带来的健康风险高于晴天。