基于TCGA数据库应用生物信息学方法分析和挖掘肺腺癌预后和诊断miRNA研究

赵丹，牟海军，石寒冰，毕红霞，姜云飞，刘国华，郑红艳，刘波

（1.齐齐哈尔医学院医学技术系，黑龙江 齐齐哈尔 161005；2.齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸与危重症医学科，黑龙江 齐齐哈尔 161005）

据2020 年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据，中国2020 年新发肺癌82万例，死亡人数71万，成为世界第一肺癌大国，严重威胁人类生命安全[1-2]。肺腺癌发生率最高，占肺癌的50%。其早期症状不明显，确诊时常处于晚期，失去手术机会，5 年生存期仅为15%左右。而早期发现并进行手术治疗的肺腺癌5 年生存率接近100%[3-4]。因此，肺腺癌的早发现、早诊断、早治疗是改善预后的关键。探寻生物学标志物，对肺癌进行早期诊断及预后判断有重要意义。近年来，发现miRNA 失调在肺癌的发生发展过程中发挥重要作用，其可影响肿瘤增殖、血管新生、转移和耐药等，与肺癌早期诊断及预后密切相关[5-6]。因此，本文通过生物信息学方法分析TCGA 数据库中肺腺癌的表达及临床数据，挖掘肺腺癌预后和诊断miRNA生物学标志物，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 数据下载及处理 于TCGA 数据库网站下载肺腺癌患者的miRNA测序数据及临床数据，共得到肺腺癌组织521 例，正常肺组织46 例。应用Perl 语言（5.24.3 版）将原始miRNA 测序数据转换成miRNA 表达矩阵。在数据处理分析过程中，当遇到有多个探针检测同一miRNA 表达量，用该miRNA 表达量的平均值作为miRNA 的表达值。对于临床数据的分析，需删除生存时间缺失和生存时间为0 的患者。

1.2 筛选差异表达miRNAs 应用R-version 3.6.2软件中的edgeR包筛选肺腺癌组织和正常肺组织的差异miRNA，以│logFC│＞2，P＜0.05 为筛选条件。使用ggplot2 和heat-map 程序包绘制差异miRNA的火山图和热图。

1.3 筛选与预后相关miRNAs 应用R-version 3.6.2软件中的survival包绘制高表达组和低表达组KM 生存曲线，以P＜0.05 为标准，筛选出与肺腺癌患者预后显著相关的miRNAs。

1.4 筛选可作为肺腺癌诊断的miRNAs 应用R-version 3.6.2 软件中的pROC 包制作受试者工作特征曲线（ROC），计算AUC 曲线、敏感性、特异性、cut-off值、约登指数等，评价与预后相关miRNAs诊断肺腺癌的价值，应用ggplot2包进行可视化。

2 结果

2.1 差异表达miRNAs 利用│logFC│＞2，P＜0.05 为筛选条件，共筛选到肺腺癌与正常肺组织差异表达的miRNA 144个，上调表达的有119个、下调表达25个，见图1。

图1 肺腺癌与正常肺组织之间差异基因Figure 1 The differentially expressed miRNA between LAUD and Normal(volcano plot and heatmap)

2.2 筛选与预后相关miRNAs 绘制上述差异miRNAs 的 KM 生存曲线，计算每个 miRNA 与肺腺癌患者生存的P值，筛选出与预后显著相关的miRNA 13 个，具体为hsa-miR-139-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-let-7g-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-147b、hsamiR-31-5p、hsa-miR-548v、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-31-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-4664-3p、hsa-miR-1293、hsa-miR-615-3p，其中hsa-miR-147b、hsa-miR-4664-3p、hsa-miR-1293、hsa-miR-615-3p与预后呈负相关，其他呈正相关，见图2。

图2 预后相关miRNAs生存曲线Figure 2 Survival curve of prognosis related miRNAs

2.3 筛选与肺腺癌诊断相关miRNAs 应用ROC评价上述与预后相关miRNAs 诊断肺腺癌的AUC曲线、特异性和敏感性、约登指数等，其中hsa-miR-147b、hsa-miR-142-3p、hsa-let-7g-3p、hsa-miR-139-3p 4 个 miRNA 的 AUC 曲线＞0.9，分别为 0.904、0.927、0.945、0.965，提示具有较高诊断价值及准确性，见图3，表1。

图3 ROC曲线Figure 3 ROC curves

3 讨论

我国肺癌发病率及死亡率仍居恶性肿瘤第1位，其中非小细胞肺癌占85%，肺腺癌占50%，发病率较高。肺腺癌起病隐匿，早期无典型临床症状，因此，确诊困难，初次诊断时多为中晚期，通常错过最佳时机且存在转移的风险。miRNA 表达与肺腺癌发生、发展、转移等相关。李煜[8]研究体外细胞研究发现，miR-629-5p能明显增强肺腺癌细胞的体外迁移能力。动物体内研究发现，miR-629-5p过表达显著促进了A549细胞肺表面转移结节的形成。莫俊贤等[9]发现，肺腺癌组织中miRNA-21表达高于癌旁组织和非癌肺组织，其中Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者。马明哲[10]研究发现，肺腺癌组织中miR-1205的含量高于邻近癌旁组织，miR-1205表达与肿瘤大小和TNM 分期显著相关，且miR-1205 低表达患者的预后优于高表达患者。周燕等[11]研究表明，hsa-miR-23a-3p 在肺腺癌组织中高表达，且与淋巴结转移、肿瘤大小和TNM分期相关，可用于辅助诊断肺腺癌。因此，筛选一些可作为预后及诊断评价的miRNA生物学标志物，具有重要的研究意义。

本研究从TCGA下载获取肺腺癌miRNA表达谱数据，包括miRNAseq和临床数据，通过生物信息学方法进行分析与挖掘，筛选到包括hsa-miR-139-3p、hsamiR-328-3p、hsa-let-7g-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-147b、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-548v、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-31-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-4664-3p、hsamiR-1293、hsa-miR-615-3p共13个miRNA，其中hsamiR-147b、hsa-miR-4664-3p、hsa-miR-1293、hsa-miR-615-3p与预后呈负相关，其他呈正相关。进一步在13个miRNA筛选与诊断相关的miRNA，发现hsa-miR-147b、hsa-miR-142-3p、hsa-let-7g-3p、hsa-miR-139-3p对肺腺癌具有较高的诊断价值，AUC分别为0.904、0.927、0.945、0.965。张妮等[12]收集100例肺腺癌患者的新鲜血液标本，应用RT-PCR 方法检测miRNA-1293 和miRNA615的表达，发现miRNA-1293和miRNA-615表达显著升高，与预后呈负相关，与本研究结果一致。Lu等[13]构建了6个microRNA（miR-17、miR-190b、miR-19a、miR-19b、miR-26b和miR-375microRNA）模型，鉴别肺腺癌和正常人，诊断准确率较高（训练和验证队列分别为AUC 0.873和0.868）。Helal等[14]利用qRTPCR检测细胞癌患者miRNA-17和miRNA-222的表达，结果发现，miRNA17和miRNA222水平明显高于正常人群。有转移的肺癌患者miRNA-17水平较高，而无转移的肺癌患者miRNA-222水平较低。ROC曲线结果，miRNA-17和miRNA-222对应的AUC分别为0.833和0.542。Zhang等[15]研究miRNA-17-5p对非小细胞肺癌的诊断率，AUC曲线为0.738（敏感性为66.7%，特异性为76.6%）。与上述研究比较，本研究获得miRNAs的AUC更高，提示准确率更高。

综上所述，本研究成功找到了4 个与肺腺癌预后显著相关，同时对肺腺癌的具有较高诊断价值的miRNA。本研究结果为肺腺癌临床诊断、病情监测及预后评估提供了一定的科学依据。但本研究仍存在局限性，需要进一步收集更多的循证医学证据去验证。