类风湿关节炎患者血浆miR- 146a表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系

庞琳烜，杨西超，李治琴，杜望磊

(空军军医大学第一附属医院 临床免疫科，陕西 西安 710032)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性、多因素和进行性自身免疫性疾病[1]。表观遗传学机制的认识为理解RA的发病机制带来了新的方向[2- 3]。近年来，微小RNA(microRNA，miRNAs)已成为研究热点[4]，例如miR- 146a被认为是先天性和适应性免疫细胞分化和功能的重要调节因子[5- 7]。有研究证实，miR- 146a启动子中NF- kB结合位点的高甲基化与骨关节炎软骨细胞和滑膜细胞中miR- 146a表达下调相关[8]。在目前的文献中，没有关于自身免疫性疾病患者miR- 146a启动子区域甲基化的报道。本研究旨在评估RA患者血浆miR- 146a表达及基因甲基化水平，并将其与疾病活动性相关联，从而为确定miR- 146a在控制RA患者疾病活动中的临床意义提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2019年3月至2020年4月在我院临床免疫科招募122例RA患者为RA组，男26例，女96例，年龄22～95岁，中位年龄68岁，病程3～57个月，患者均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟修订的RA诊断和分类标准。所有患者在采集血样之前接受了至少6个月的甲氨蝶呤(MTX)治疗。排除存在任何感染、其他自身免疫性疾病、其他关节疾病或恶性肿瘤等严重疾病的患者。选择同期健康志愿者141例为对照组，男30例，女111例，年龄22～91岁，中位年龄65岁，年龄和性别均与RA组匹配(P>0.05)，均无自身免疫性疾病、免疫缺陷和恶性肿瘤家族史。根据《赫尔辛基宣言》的原则，所有研究对象均知情同意，我院伦理委员会审查批准了本研究。

1.2 疾病活动程度评估

采用罗氏Cobas 8000 C702型全自动生化分析仪检测红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)水平。基于ESR获得28个关节疾病活动评分(DAS28- ESR)[9]测量疾病活动性。将所有RA患者分为缓解组(DAS28- ESR≤2.6分)及疾病低活动度组(2.6分

1.3 血浆miR- 146a水平检测

在EDTA涂层小瓶中采集血样(5 ml)，以分离血浆。部分样本用于实验室参数包括CRP、ESR、补体C3和C4、类风湿因子(RF)和抗环瓜氨酸肽(抗CCP)分析。样品离心后储存于-20 ℃直到分析。另一部分血浆冷冻在含有EDTA的试管(-80 ℃)中直到miRNA表达定量分析。利用miRNA Mini试剂盒(美国Invitrogen)从血浆中分离miRNA。提取后采用miRNA扩增试剂盒(美国Applied Biosystems)进行cDNA合成。在最后20 μl体积中进行扩增反应，将三步qPCR的热循环设定在95 ℃下30 s作为保持时间，然后95 ℃变性5 s和60 ℃退火20 s进行40次循环，并在72 ℃下延伸30 s。得到55 ℃～99 ℃温度下的扩增曲线和循环阈值(Ct)。U6 snRNA的表达被用作数据标准化的内源性对照，使用2-ΔΔCt方法计算miR- 146a相对表达量，ΔCt=CtmiR- 146a-CtU6，ΔΔCt=ΔCtRA组-ΔCt对照组。从Ensembl基因组浏览器中获得了miR- 146a(pri- miR- 146a)转录起始位点(TSS)上游启动子的500个碱基对。用TFBIND软件扫描上述区域，寻找预测的转录因子结合位点。PCR引物序列如下：miR- 146a：正向5′- ACTGAATTCCATGGGTTGTGTC- 3′，反向5′- TGACAGAGATATCCCAGCTGAAG- 3′；U6：正向5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′，反向5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。

1.4 定量甲基化特异PCR(qMSP)分析

用甲基引物表达软件设计了两对靶向区引物；一个能识别甲基化DNA，另一个能识别非甲基化DNA。在qMSP反应中，用Epipect Master Mix和0.75 μmol·L-1引物(源自Methlyl Primer Express v1.0软件)扩增2 μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA。PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(美国Qiagen)清洗，使用实时PCR仪器(ABI 7300，美国Applied Biosystems)对miR- 146a基因调控元件的特定区域进行qMSP。通过在标准曲线中插入非甲基化引物循环阈值减去甲基化引物循环阈值(CtU- CtM)的差值作为ΔCt，利用2-ΔΔCt方法来计算DNA甲基化值。使用甲基化和非甲基化人类对照样品与0%、10%、25%、50%、75%、90%及100%甲基化DNA的混合物构建计算DNA甲基化值的标准曲线。引物序列如下：M- miR- 146a：正向5′- TGGGTAGTCGATAAAGTTTTC- 3′，反向5′- AATACTTTAACCTACGCGCT- 3′；U- miR- 146a：正向5′- ATTGGGTAGTTGATAAAGTTTTT- 3′，反向5′- TAATACTTTAACCTACACACTC- 3′。

1.5 统计学处理

使用SPSS 26.0软件处理数据。二分类变量以率(频率)表示，行卡方检验；偏态分布数据以中位数(四分位值[IQR])表示，采用Kruskal- Wallis检验和事后Mann- Whitney U分析；采用Spearman相关系数法分析相关性，多元线性回归模型分析血浆miR- 146a及基因甲基化水平与疾病活动指标的关系。双侧P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较

RA组患者血浆miR- 146a、ESR、CRP水平显著高于对照组，miR- 146a基因甲基化水平显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 血浆miR- 146a表达与基因甲基化的关系

经Spearman秩相关系数分析，患者血浆miR- 146a水平与miR- 146a基因甲基化水平呈负相关(rs=-0.184，P=0.042，图1)。

图1 血浆miR- 146a水平与miR- 146a基因甲基化水平的关系

2.3 不同疾病活动程度RA患者临床资料比较

随疾病活动程度的增加，RA患者血浆miR- 146a水平呈升高趋势，miR- 146a基因甲基化水平呈下降趋势(P<0.05)。疾病高活动度组RA患者血浆miR- 146a水平显著高于中活动度组、低活动度组和缓解组(P<0.05)；高活动度组miR- 146a基因甲基化水平显著低于低活动度组和缓解组(P<0.05)。见表2。

表2 不同疾病活动程度RA患者临床资料比较

2.4 血浆miR- 146a表达及基因甲基化与RA患者其他指标之间的关系

经Spearman秩相关系数分析，血浆miR- 146a水平与DAS28- ESR评分、ESR、CRP水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、SDAI呈正相关(P<0.05)，miR- 146a基因甲基化水平与DAS28- ESR评分、ESR、CRP水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、SDAI呈负相关(P<0.05)，而两者均与病程、HAQ评分、HAQ- DI评分、ACPA滴度、RF滴度、RA X线分期无关(P>0.05)，见表3。

2.5 多元线性回归分析

进一步校正年龄、性别、体质指数、病程、RF滴度、ACPA滴度以及治疗方案等可能的干扰因素后，经多元线性回归分析，血浆miR- 146a表达与DAS28- ESR评分、ESR、CRP水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、SDAI仍呈正相关(P<0.05，表4)；同样，血浆miR- 146a基因甲基化水平与DAS28- ESR评分、ESR、CRP水平、关节肿胀计数、医生总体评估、SDAI仍呈负相关(P<0.05，表5)。

表4 血浆miR- 146a表达与RA患者疾病活动指标的关系

表5 血浆miR- 146a基因甲基化水平与RA患者疾病活动指标的关系

表3 血浆miR- 146a表达及基因甲基化与RA患者主要临床指标之间的关系

3 讨 论

RA是一种自身免疫性疾病，其特征是滑膜组织的慢性炎症，最终导致不可逆转的关节破坏和终身残疾[1]。表观遗传学在RA的发病机制中起重要作用，尤其是DNA甲基化和非编码RNA[3]。本研究中我们分析了RA患者血浆中miR- 146a表达及甲基化水平是否可能是RA患者疾病活动严重程度的潜在标志物。我们证实，RA组患者血浆miR- 146a水平显著高于对照组，miR- 146a基因甲基化水平显著低于对照组，且二者与疾病活动程度密切相关，有望成为早期预测和控制RA患者疾病活动的有效生物标志物。

miRNA是一类长度为21～25个核苷酸的非编码RNA，是调节细胞发育、先天性和获得性免疫反应相关基因表达的主要表观遗传学机制之一[2,10]。DNA甲基化导致的miRNA转录沉默已在不同类型的疾病中得到证实，这表明它包括导致异常miRNA表达的机制[11]。本研究中我们证实了RA组和对照组之间miR- 146a甲基化水平的显著差异。我们发现RA患者miR- 146a基因甲基化水平显著降低。这些结果与基因启动子区域的过度甲基化导致其蛋白质合成减少的一般表观遗传原理[10]一致。正如预期的那样，我们证实miR- 146a基因高甲基化水平与较低的miR- 146a表达相关。在RA患者中我们注意到，DAS28评分较高的患者有较高的血浆miR- 146a水平和较低的基因甲基化水平趋势。关于RA中miR- 146a甲基化水平的文献很少，但在其他情况下也发现了类似的结果。例如，在骨关节炎患者的软骨细胞和滑膜细胞中，miR- 146a调节区中特定CpG位点的超高甲基化与miR- 146a的下调相关，这可能有助于骨关节炎的进展[8]。在肺癌细胞中，启动子高甲基化导致miR- 146a表达受到显著抑制[12]。

据报道，miRNA与炎症控制、滑膜细胞生长及破骨细胞生成密切相关，从而影响RA患者的疾病活动性和严重程度[13]。本研究中我们发现，与对照组相比，血浆miR- 146a水平显著上调，并且血浆miR- 146a水平与患者疾病活动指标包括DAS28- ESR评分、SDAI、CRP水平、ESP、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估呈正相关。其他作者也发现 RA患者miR- 146a表达增加，并且与DAS28- ESR评分、CRP水平及SDAI呈正相关[13]。以往研究表明，上调的miR- 146a可通过多种促炎机制促进RA的进展[6,13]。miR- 146a是调节性T细胞(Treg细胞)的抑制功能和Th1反应的抑制所必需的，Th1反应是诱导和维持炎症的关键因素[6,14]。在许多免疫细胞包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和产生白细胞介素(IL)- 17的CD4+细胞中，miR- 146a显著上调，并且发现它与肿瘤坏死因子- α(TNF- α)及IL- 17水平呈正相关[15]。此外，在RA患者的T细胞中miR- 146a水平与控制T细胞死亡的Fas相关因子1(FAF1)水平呈负相关，miR- 146a的增加最终导致T细胞凋亡抑制，促进RA炎症的发生[6]。miR- 146a表达增加可能通过减少T细胞死亡和诱导TNF- α、IL- 17等来促进RA炎症反应[6,15]。总之，miR- 146a在免疫调节以及RA疾病活动中是重要的表观遗传调节因子。

综上，随着疾病活动程度的增加，RA患者血浆miR- 146a水平升高，基因甲基化水平降低。我们证实血浆miR- 146a及基因甲基化状态与RA患者疾病活动程度有关，可能成为诊断和控制RA疾病活动的潜在标志物，并有助于进一步了解RA进展机制。但本研究仍有局限性：首先，研究纳入样本量较小，因此需要更多更大的研究来确认；其次，对照组仅限于健康个体，应考虑其他疾病如红斑狼疮、感染、骨关节炎、其他炎症性疾病患者的对照组。此外，miR- 146a及基因甲基化在RA发病机制中的作用尚不明确，仍需进一步研究。