胚胎期双酚A暴露对斑马鱼眼结构及视觉功能影响的研究

杨小依，张舒纯，张昕，李景云，池霞，童梅玲

(1.南京医科大学 儿科学院，江苏 南京 210029； 2.南京医科大学附属妇产医院 儿童保健科，江苏 南京 210004； 3.常州市儿童医院，江苏 常州 213003； 4.南京医科大学附属妇产医院 医学研究中心，江苏 南京 210004)

双酚A(bisphenol A，BPA)，作为高分子合成材料的重要原料之一，广泛应用于黏合剂、罐头内壁、人造牙齿、食品包装材料等日常生活用品和工业用品的生产中[1]。目前，在水体、土壤、室内灰尘等环境介质中经常可检测到BPA[2]。BPA可以通过消化道、呼吸道和皮肤等多种途径进入人体[3]，对人类健康产生危害。研究发现，BPA能通过胎盘屏障进入胎儿体内并且在胎儿体内存在清除延迟现象，导致子代儿童出现对比敏感度降低等视觉发育异常表现[4- 5]，但目前有关孕期BPA暴露对子代视觉发育影响的作用机制尚无深入报道。

斑马鱼因具有产卵量大、发育迅速、视网膜结构与人类相似、基因组与人类同源性高等特点[6]，被广泛应用于毒理学、视觉发育等的研究中[7]。本研究在前期实验的基础上，以斑马鱼为动物模型，通过构建胚胎期BPA暴露的斑马鱼模型，研究BPA暴露后子代斑马鱼眼部形态及视觉行为学变化，系统探索胚胎期BPA暴露对斑马鱼眼结构及视觉功能的影响，为环境污染物暴露致子代视觉损害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

研究所用成年野生型TU品系斑马鱼购自南京尧舜禹生物有限公司，并根据斑马鱼养殖指南雌雄分开饲养于通信作者所在实验室斑马鱼自动化养殖系统：水温为(28.5±0.5) ℃；pH值为6.8～7.5；光周期为14 h光照∶10 h黑暗，每天早晚各喂食1次新鲜孵化的丰年虾。

1.2 主要实验试剂与仪器

BPA(CAS No.80- 05- 7, 纯度99.9%)、DMSO(CAS No.67- 68- 5)均购自Sigma- Aldrich公司，斑马鱼自动化养殖系统购自上海海圣生物实验设备有限公司，恒温培养箱购自上海爱朗仪器有限公司，体视显微镜购自徕卡显微系统公司，VisioBox和ZebraBox斑马鱼行为学分析系统购自Viewpoint公司。

1.3 实验方法

1.3.1 斑马鱼胚胎收集及染毒

实验前一天下午喂食后，将成年雌雄鱼按1∶2配对放入配种缸，隔板将雌雄鱼分隔，第2天早上开灯后1 h内抽去隔板使雌雄鱼接触交配，完成交配后收集胚胎。

于受精后4 h(4 hour post- fertilization，4 hpf)去除发育停滞的胚胎，随机选取80枚发育良好的胚胎，分别放置在含10 ml不同暴露浓度BPA溶液的培养皿中，同时设置溶剂对照组(0.1%DMSO)。结合前期实验测定的BPA暴露对斑马鱼半致死浓度LD50为58.37 μmol·L-1(数据未发表)及相关文献，本实验设置BPA暴露浓度分别为0、0.1、1、10、50 μmol·L-1，暴露时间为4～144 hpf。为保证BPA暴露浓度的稳定，每隔24 h更换新鲜配置的染毒液。

1.3.2 胚胎期 BPA暴露后子代斑马鱼的眼部大体形态变化

每天上午11:00通过体视显微镜观察斑马鱼不同阶段的发育情况。随机选取不同暴露组的96 hpf斑马鱼幼鱼各6条，在体视显微镜下拍摄并记录幼鱼俯视图和侧视图，利用Image J软件测量眼长、总体长和眼面积。

1.3.3 HE染色观察胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼视网膜结构的变化

随机选取不同暴露组的96 hpf斑马鱼幼鱼各6条，使用4%多聚甲醛过夜固定，经梯度酒精脱水、二甲苯透明处理后浸蜡包埋。蜡块经常规切片、苏木精伊红染，封片后于显微镜下观察。

1.3.4 胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼的视觉行为学分析

1.3.4.1 斑马鱼自主摆尾能力 在24 hpf，随机选取各组胚胎20枚，在体视显微镜下观察记录各组斑马鱼胚胎摆尾次数，每次记录2 min，折算成每1 min摆尾频次，重复3次实验。

1.3.4.2 斑马鱼眼动反应(optokinetic response，OKR) 在96、120 hpf，使用VisioBox仪器检测幼鱼的眼动反应。随机选取不同组的斑马鱼幼鱼，每组10条，分次放入有3%甲基纤维素的35 mm培养皿中，使其背部向上，以固定空间频率(0.06 cycles·deg-1)、时间频率(16°·s-1)顺时针及逆时针各30 s的光栅刺激，记录和分析其眼动频率，重复3次实验。

1.3.4.3 斑马鱼自主运动水平及光惊吓反应 在120、144 hpf，随机选取在不同组的幼鱼，每组8条，放置于96孔板中，每孔1条幼鱼并含200 μl 斑马鱼培养液，将96 孔板放入ZebraBox观察箱。首先进行幼鱼自主运动水平的检测，检测时长为60 min，记录每条幼鱼的运动轨迹、运动距离等数据；然后进行明暗周期交替的光惊吓反应检测。先进行10 min的暗适应，适应完毕后设置光暗周期黑暗∶光照为10 min∶10 min，循环3次，以1 min为单位收集运动轨迹、运动距离等数据，测定时长共60 min，重复3次实验。

1.4 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0.1进行统计分析。不同实验组间采用单因素方差分析(One- way ANOVA)，以Dunnett法进行组间两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。所有图中显示的误差条代表平均值的标准误差。

2 结 果

2.1 胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼眼结构情况

随着BPA暴露时间的延长，各组斑马鱼胚胎均开始孵化、存活。在96 hpf，斑马鱼胚胎基本孵化完全，在体视显微镜下检测不同组斑马鱼幼鱼眼长、体长、眼面积，结果显示：BPA暴露组幼鱼的眼面积减小，并随着BPA暴露浓度的升高，眼面积的减小愈发显著，尤其是50 μmol·L-1BPA暴露组与对照组相比眼面积显著下降21.81%(P<0.01)(图1A、B)。进一步计算幼鱼眼长与身长比例发现，50 μmol·L-1BPA暴露组中幼鱼的眼长与体长比例较对照组也明显下降，差异具有统计学意义(图1B)。

接着，本研究通过HE染色观察BPA暴露对幼鱼96 hpf视网膜分层结构的影响，结果显示：对照组中幼鱼视网膜分层清晰、各层细胞排列规整，从内到外依次可见神经节细胞层、双极细胞层、感光细胞层；0、0.1 μmol·L-1BPA暴露组幼鱼的视网膜亦有较明显的分层结构，而1 μmol·L-1BPA暴露组中幼鱼视网膜分层结构开始出现紊乱，且随着BPA暴露浓度增加，紊乱越来越明显，尤其是10、50 μmol·L-1BPA暴露组幼鱼的视网膜各层逐渐分层不清，其中尤其是感光细胞层细胞数目减少、排列紊乱(图1C)。

图1 BPA暴露对子代斑马鱼眼结构的影响 A.斑马鱼幼鱼大体形态； B.斑马鱼眼面积、眼长与体长比，a 与对照组相比，P<0.01； C.96 hpf幼鱼的视网膜结构

2.2 胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼的行为表现

2.2.1 胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼自主摆尾运动

发育至24 hpf时，神经发育良好的斑马鱼胚胎可出现规律的尾部自主摆动。检测各组胚胎的自主摆尾活动，结果显示，对照组胚胎摆尾频次约为6.650次·min-1，而BPA暴露组总体自主摆尾频次随着BPA浓度升高呈现出下降趋势，其中10、50 μmol·L-1BPA暴露组斑马鱼胚胎自主摆尾频率分别减少18.05%(P<0.01)、35.71%(P<0.001)，差异具有统计学意义(图2)。

图2 24 hpf斑马鱼胚胎自主摆尾频次 a 与对照组相比，P<0.001； b 与对照组相比，P<0.01

2.2.2 胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼视动反应

发育至96 hpf时，斑马鱼已具备基本的视觉功能，可以通过OKR检测其视觉功能的情况[8]。结果显示，随着BPA暴露浓度的升高，96 hpf幼鱼的眼动频率和幅度均呈现降低趋势，其中10、50 μmol·L-1BPA暴露组幼鱼的眼动幅度较对照组明显减小，眼动频率分别减少7.1%(P<0.001)和4.2%(P<0.001)(图3A)。当幼鱼发育至120 hpf时，BPA暴露组斑马鱼也有相同眼动频率和幅度降低的趋势，在10、50 μmol·L-1BPA暴露组中差异显著(图3B)。

图3 BPA暴露对子代斑马鱼OKR的影响 A. 96 hpf斑马鱼幼鱼眼动频率； B.120 hpf斑马鱼幼鱼眼动频率； a 与对照组相比，P<0.001

2.2.3 胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼运动轨迹

当幼鱼发育至120、144 hpf时，本研究利用斑马鱼行为学分析系统检测其自主运动和光惊吓运动的能力。首先，行为学测试记录幼鱼运动轨迹结果显示，120、144 hpf运动轨迹呈现相同的趋势：随着BPA暴露浓度升高，其运动轨迹变得杂乱无章，逐渐失去贴壁运动的特性和正常的明暗周期运动节律(图4A)。

接着，自主运动能力检测显示，120 hpf时，溶剂对照组与空白对照组幼鱼游动距离无明显差异，而随着BPA暴露浓度升高，幼鱼的游动距离显著缩短。相较于120 hpf，144 hpf幼鱼的总游动距离均有所提升，但是10、50 μmol·L-1BPA暴露组减少40.93%(P<0.001)、46.48%(P<0.001)(图4B)。

斑马鱼在明暗交替的刺激时会表现出正常的运动节律，即在光照下斑马鱼表现出低速运动，在黑暗环境中其运动速度较快。因此，本研究还设计了规律出现的明暗交替刺激，以此来评价幼鱼的光惊吓能力。结果发现，发育至120 hpf，1、10、50 μmol·L-1BPA暴露组的幼鱼在黑暗刺激下运动总距离缩短，10、50 μmol·L-1BPA暴露组暗周期运动距离对比明周期未见较大增加。而发育至144 hpf，仅10、50 μmol·L-1BPA暴露组的斑马鱼明暗周期下运动距离与对照组相比有显著缩短(图4C)。

图4 BPA暴露对子代斑马鱼运动行为的影响 A.120 hpf幼鱼1 min游动轨迹； B.120及144 hpf幼鱼自主运动总距离； C.120及144 hpf幼鱼光暗刺激下运动距离； a 与对照组相比，P<0.001； b 与对照组相比，P<0.01； c 与对照组相比，P<0.05

3 讨 论

近年来，越来越多的研究聚焦于环境污染物所产生的视觉毒性。Huang等[9]发现，多环芳烃暴露会造成细胞凋亡和使细胞增殖减少，从而导致视觉系统发育缺陷；Chen等[10]发现，多溴联苯醚可以通过干扰眼睛发育相关基因的表达，损伤视网膜结构，从而导致视觉功能障碍。BPA作为双酚类化合物中最常见的环境污染物，导致子代儿童的红绿色觉异常[5]，动物实验也证实胚胎期低浓度BPA暴露影响日本青鳉正常的眼色素沉着[11]，提示BPA暴露对子代视觉发育造成了一定的影响，然而其具体作用机制需要进一步探索。斑马鱼是一种广泛用于眼发育研究的模式动物，其视觉系统较为发达，且视网膜结构与人类相似[12]。因此，本研究在前期研究的基础上，以斑马鱼为模式动物，通过构建胚胎期BPA暴露的斑马鱼模型来阐明胚胎期BPA暴露对子代斑马鱼眼结构和视觉功能的影响，从而为环境污染物暴露致子代视觉损害提供理论依据。

首先本研究测量了胚胎期BPA暴露后的斑马鱼幼鱼眼面积、眼长、体长，结果表明，50 μmol·L-1BPA暴露后斑马鱼眼面积明显减小。有研究发现，斑马鱼胚胎暴露于四溴双酚A会导致受精后第5天的仔鱼眼睛大小显著减小[13]，提示胚胎期高浓度BPA暴露将影响斑马鱼眼外观形态正常发育。我们通过眼部组织切片及HE染色来评估胚胎期BPA暴露对斑马鱼视网膜结构的影响，结果发现，1、10、50 μmol·L-1组中幼鱼视网膜各层逐渐分层不清，尤其是感光细胞层细胞数目减少、排列紊乱。以上结果表明，尽管较低浓度的BPA暴露后斑马鱼幼鱼眼睛大体外观未出现明显改变，但是其视网膜的结构出现了紊乱，细胞形态不规则，提示胚胎期较低浓度BPA仍可对子代眼结构的发育产生影响。

为进一步探究胚胎期BPA暴露对斑马鱼视觉功能的影响，本研究通过不同时期的行为学实验评估胚胎期BPA暴露后斑马鱼的视觉行为。研究资料表明，斑马鱼拥有明暗感知、光惊吓反应、趋光反应的前提是具备完善的视觉功能[14- 15]，因此行为学实验可以被认为是评估视觉功能的一种方法[16]。24 hpf时，斑马鱼神经开始发育，此时视网膜神经节细胞出现。随后，神经节细胞的突触逐渐延伸，发育至48 hpf时到达视顶盖。74 hpf时，斑马鱼与视觉相关的视网膜细胞基本发育成熟，并初具功能[8,17]。随着发育时间的延长，视网膜功能在144 hpf基本成熟。因此，本研究选取了不同的时间点进行视觉行为的检测。24 hpf的自主摆尾能力检测发现，BPA暴露浓度为10 μmol·L-1时斑马鱼幼鱼的自主摆尾能力已受到影响，这表明，即使在胚胎期较低浓度BPA暴露下，斑马鱼的神经发育仍然受到伤害。96、120 hpf时，OKR检测发现BPA暴露后斑马鱼幼鱼的眼动反应能力逐渐减弱。相似的是，Baumann等[13]也发现，斑马鱼胚胎暴露于TBBPA 后，受精后第5天的斑马鱼幼鱼OKR呈现出剂量依赖性减弱。本研究又进一步通过120、144 hpf 视觉运动反应检测发现，从较低浓度BPA暴露起，斑马鱼幼鱼的运动能力和明暗感知能力受损，表现为运动能力下降及暗周期运动能力无明显提高。Fraser等[18]亦发现BPA暴露后将导致斑马鱼幼鱼光暗循环运动出现改变。有趣的是，在0.1、1 μmol·L-1BPA暴露下发育至144 hpf 与同浓度暴露的120 hpf斑马鱼幼鱼相比，其运动水平及对光照的反应均有所恢复。而既往研究也已证实斑马鱼视网膜存在强大的损伤后再生能力[19]，其相关机制有待进一步研究。胚胎期BPA暴露后子代斑马鱼不同发育时期的视觉行为学改变均表明，胚胎期低浓度BPA已影响斑马鱼幼鱼的正常视觉行为，提示BPA在斑马鱼胚胎发育早期已对视网膜的发育产生了影响，从而导致异常的视觉功能。

综上所述，本研究的结果证实，胚胎期BPA暴露可造成斑马鱼视网膜结构出现改变，导致视网膜分层结构紊乱，引起异常视觉行为，提示环境污染物可对子代视觉的发育造成一定的影响，这为环境污染物暴露致子代视觉损害提供了理论依据，也提示了儿童的眼保健要从母亲孕期保健开始，避免接触环境污染物，为后代的眼健康打下良好的基础。