睾丸穿刺取精联合ICSI助孕临床结局的影响因素分析

贾洪响，张杨，张莉莉，甘楚文，杜孟鸽，何驰华

(1. 荆州市中心医院 生殖医学科，湖北 荆州 434020； 2. 长江大学 医学部，湖北 荆州 434020)

不孕不育正成为当今社会关注的一个重要问题，近10年来中国男性精液质量随着时间变化呈持续下降的趋势[1]。对临床上出现的越来越多的少弱畸精症患者，可通过卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)将配子培养成胚胎后进行胚胎移植助孕；而对梗阻性无精症患者及射精障碍患者，因输精管梗阻其精液中未见精子或无法取到精子，可通过睾丸穿刺取精(testicular sperm aspiration，TESA)获取活动精子，再经ICSI助孕。本研究对行TESA联合ICSI助孕的132例患者(共136周期)的临床资料进行回顾性分析，探究TESA- ICSI周期临床结局的影响因素，旨在为患者选择助孕方案和预测临床结局提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

收集2017年1月至2021年12月间在荆州市中心医院生殖医学科行TESA联合ICSI助孕的132例患者(共136个周期)的临床资料，其中梗阻性无精症122周期、射精障碍14周期，设为TESA组。纳入标准：(1) 因男方患有梗阻性无精症或射精障碍于取卵日行TESA获取活动精子；(2) 取卵当日女方取到成熟卵子并行ICSI助孕。排除标准：(1) 女方患有子宫畸形、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、输卵管积水等病变；(2) 双方染色体核型异常；(3) 女方有严重内分泌系统疾病；(4) 女方年龄>40岁。另选取同时期因男方因素取精液中精子行ICSI助孕，排除标准同TESA组，共纳入498例患者(共517周期)为精液组。通过对比，观察睾丸精子对TESA- ICSI周期临床结局的影响，然后将TESA组患者根据临床结局分为妊娠组(88例)和未妊娠组(48例)，采用单因素分析和多因素Logistic回归分析探究TESA- ICSI周期临床结局的影响因素。本研究未涉及伦理问题，患者行TESA及ICSI前均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性促排卵及卵母细胞收集 采用荆州市中心医院生殖医学科常规促排卵方案进行控制性促排卵，当女方优势卵泡直径≥18 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)扳机，注射后36 h在阴道B超引导下穿刺取卵，体式显微镜下收集卵冠丘复合物(OCCCs)，转入受精培养液置于37 ℃、含6%CO2、饱和湿度的桌面培养箱中培养。

1.2.2 睾丸穿刺取精 男方经睾丸穿刺手术取得睾丸组织，并用1 ml注射器针头将睾丸组织充分撕碎，使曲细精管中的精子尽可能释放到培养液中，将收集的精液或组织悬液用梯度离心法洗涤，处理后获得的沉淀用预平衡的受精培养液(COOK，美国)洗涤后制成精子悬液备用。

1.2.3 授精及胚胎培养 取卵后2 h 用80 U·L-1的透明质酸酶(SAGE，美国)脱掉OCCCs四周包裹的卵丘细胞，用于行ICSI。操作结束后将卵子转入平衡好的卵裂培养液(COOK，美国)微滴中，置于37 ℃、含6%CO2、饱和湿度的桌面培养箱中培养。

1.2.4 胚胎评分及妊娠判定 ICSI后16～18 h 观察受精情况，卵母细胞内出现双原核(2PN)为正常受精。卵裂期胚胎评分根据Peter评分标准、囊胚根据Gardner评分标准进行评分。胚胎移植后5周B超检查孕囊，可见孕囊者判定为临床妊娠。

1.2.5 观察指标 记录患者双方年龄、不孕年限、孕产史、促性腺激素(Gn)用量、子宫内膜厚度、促排卵方案、获卵数、可利用胚胎数、移植方案等基本资料，统计受精率、正常受精率、正常卵裂率、可利用胚胎率和累积临床妊娠率[2]等数据，各指标计算公式参照胚胎实验室关键指标质控专家共识。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 TESA组和精液组患者夫妇一般资料比较

TESA组和精液组患者夫妇年龄、不孕年限、Gn总量及子宫内膜厚度间的差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 TESA组和精液组患者夫妇一般资料比较

2.2 TESA组和精液组胚胎发育和临床结局比较

TESA组的受精率和正常受精率均显著低于精液组(均P<0.05)，而第二次减数分裂中期(metaphase Ⅱ)卵母细胞率(简称MⅡ卵率)、正常卵裂率、可利用胚胎率及累积临床妊娠率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 TESA组和精液组胚胎发育及临床结局比较

2.3 TESA- ICSI周期临床结局的单因素分析

将TESA- ICSI周期按照临床结局不同分为妊娠组和未妊娠组。两组在女方年龄、男方年龄、不孕年限、获卵数、可利用胚胎数和基础黄体生成素(LH)方面差异均有统计学意义(均P<0.05)；而在Gn总量、子宫内膜厚度、双方体质指数(BMI)，基础促卵泡素(FSH)、基础泌乳素(PRL)、基础雌二醇(E2)、基础孕酮(P)、基础睾酮(T)、抗苗勒氏管素(AMH)、hCG日LH、hCG日E2、hCG日P水平，孕产史、促排卵方案、移植方案方面差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 TESA- ICSI周期临床结局的单因素分析

2.4 TESA- ICSI周期临床结局影响因素的多因素Logistic回归分析

将TESA- ICSI周期临床结局单因素分析筛选出的具有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，男方年龄及获卵数与TESA- ICSI周期临床结局存在显著关联(P<0.05)，见表4。

表4 TESA- ICSI周期临床结局影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

TESA联合ICSI助孕在临床上应用已有近30年，Lewin等[3]于1996年报道了经皮睾丸抽吸取精行ICSI并获得妊娠。但与精液来源的精子相比，TESA来源的精子对患者临床结局的影响还存在争议。以往有研究[4]认为，睾丸精子成熟度较低，会造成受精率、临床妊娠率的下降，但近年来有越来越多的研究[5-7]显示，不同来源精子行ICSI助孕能获得相似的妊娠结局，且未明显增加婴儿出生性别差异及子代出生缺陷。还有研究[8- 9]认为，在隐匿精子症和高精子DNA碎片指数患者中应用睾丸精子可以改善临床结局。本研究发现，TESA组患者虽然在受精率和正常受精率方面低于精液组，但是两组在可利用胚胎率和累积临床妊娠率方面差异无统计学意义，我们认为睾丸精子成熟度较低、活力差和优质精子数量不足是造成TESA组受精率和正常受精率低于精液组的主要原因，但精子在睾丸中已完成了减数分裂，成为已携带父源遗传物质的单倍体，其中优质精子与卵子受精成功后形成的胚胎具有正常的发育潜能。

本研究将TESA- ICSI组的患者按照移植后是否妊娠分为妊娠组和未妊娠组，对两组患者的各项指标进行统计，分析TESA- ICSI周期临床结局的影响因素。单因素分析结果显示：男女双方年龄、不孕年限、基础LH水平、获卵数及可利用胚胎数与临床结局存在显著关联；而男女双方BMI、女方孕产史，AMH、基础FSH、PRL、E2、P、T水平及hCG日LH、E2、P水平，促排卵方案、Gn用量、移植方案等与临床结局无显著关联。在单因素分析基础上进行多因素Logistic回归分析结果显示，男方年龄和女方获卵数是TESA- ICSI周期临床结局的影响因素(P<0.05)。

在以往的报道中，男方年龄对TESA- ICSI周期临床结局影响的研究较少，而男方年龄对精子质量的影响是多方面的，因而该因素对ICSI助孕临床结局的影响还存在争议。男方年龄的增大会对精液参数产生不利影响[10- 11]，包括精液浓度的下降和精子碎片率的升高。Kawai等[12]证明了自噬和胚胎生长重要基因的表达与父亲年龄呈负相关，这可能与表达遗传修饰有关。Kaarouch等[13]的一项研究发现，在IVF周期中，随着男性年龄的增大，受精率、卵裂率、囊胚形成率、妊娠率和流产率等指标都出现了恶化。但在一项针对36岁以下妇女供卵ICSI周期的研究中，Beguería等[14]发现，不同男性年龄段的临床结局没有差异。也有文献报道，男方年龄对ICSI周期患者临床结局没有影响[15]，原因可能是在ICSI过程中可以选择质量较好的精子进行授精，从而避免精液质量下降带来的不利影响。本研究的结果显示男方年龄与TESA- ICSI周期临床结局有显著关联，分析原因可能是由于TESA来源的精子本身存活率极低，可用于ICSI注射的精子很少，随着年龄的增长，即使是人工挑选出的精子质量也在持续下降，从而影响胚胎发育潜能和妊娠能力，导致累积临床妊娠率下降。

本研究结果显示，女方获卵数也是TESA- ICSI周期临床结局的影响因素，这也与目前的多数观点相符合。谢妍等[16]发现，女性年龄和获卵数对PESA- ICSI治疗周期的妊娠结局有明显影响。在IVF周期中，获卵数与累积活产率之间存在显著的相关性，可作为预测累积活产率的指标之一[17]。陈鑫等[18]报道了PGT- M/PGT- SR助孕周期中，累积活产率随着获卵数、可活检囊胚数和可移植囊胚数的增加而逐渐上升；当每周期获卵数≥10个时，患者的累积活产率趋于平稳，不再增加。获卵数通常与女性卵巢功能和年龄相关联，随着年龄的增大，卵巢功能逐渐下降，导致获卵数减少，而获卵数过少又会造成可利用胚胎数的不足，从而影响临床结局，但是过多的卵母细胞数往往伴随着过高的雌激素和卵巢过度刺激，因此适宜的获卵数能够使临床结局获益最大[19]。在TESA- ICSI周期中，由于受精率和卵裂率等的下降会减少可利用胚胎数，因此为了保证有充足的可利用胚胎，就需要尽可能增加获卵数。

综上所述，在TESA- ICSI助孕周期中，睾丸精子来源并不是影响临床结局的因素，而男性年龄及女方获卵数与临床结局有显著相关性，因此对需要行TESA- ICSI助孕的患者来说，越早寻求辅助生殖助孕成功率越高。在促排卵过程中最好根据患者实际情况采用个性化促排卵方案，尽可能提高获卵数以增加可利用胚胎，从而提高累积临床妊娠率。同时本研究尚存在一定的局限性：首先本研究属于单中心研究，样本量较少，研究结果尚需大样本量的验证；其次是在TESA- ICSI助孕周期中可能影响临床结局的因素众多，本研究只纳入了本中心有完整记录的临床参数进行分析，在实际中可能还有其它影响因素未纳入研究，需要采用新的临床资料加以论证。