LC-MS/MS测定3种复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶虫脒及哒螨灵残留

叶 倩，朱富伟，万 凯，黄聪灵，唐雪妹

（1广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所，广州 510640；2广东省农产品质量安全风险评估重点实验室，广州 510640；3农业农村部农产品质量安全检测与评价重点实验室，广州 510640）

0 引言

复合蔬果汁饮品，旨在提供多种维生素、矿物质的同时兼具有丰富的口感而备受青睐。但由于复合蔬果汁原料为多种新鲜蔬菜水果，而蔬菜水果在种植过程中不可避免的施用农药，同时盲目或过量地使用这些农药而造成的环境污染、农药超标等问题使得蔬果汁中农药残留存在一定的隐患。吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、啶 虫 脒 (acetamiprid)、哒 螨 灵(pyridaben)作为广谱类的杀菌剂、杀虫剂以及杀螨剂，目前在农业生产中广泛应用，在初级农产品中也有一定的检出率。吡唑醚菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过抑制线粒体呼吸作用，使细胞缺乏正常代谢所需能量，最终导致细胞死亡[1]。啶虫脒作为烟碱类杀虫剂，主要作用于昆虫神经结合部后膜,通过与乙酰胆碱受体结合使昆虫兴奋-痉挛-麻痹-死亡，同时对抗有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类杀虫剂的害虫有特效[2]。哒螨灵作为一种哒嗪酮类杀螨剂，因其对食植性害螨具有明显的防治效果而被广泛应用。目前中国对吡唑醚菌酯、啶虫脒、哒螨灵在饮料类中只规定了茶叶、茉莉花、咖啡豆、啤酒花中的限量，而蔬果汁中并无相应的限量规定[3]。因此，建立快速、灵敏的检测方法，对监测复合蔬果汁中农药的残留具有一定的重要意义。

目前，吡唑醚菌酯和哒螨灵主要通过气相色谱(GC)[4-7]、液相色谱(LC)[8-11]、气相色谱-质谱联用(GCMS)[12-13]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[14-16]等检测方法进行。啶虫脒报道的比较多的检测方法主要集中于液相色谱法(LC)[11,17]和液相色谱-串联质谱法(LCMS/MS)[16,18]。由于气相色谱法、液相色谱法的灵敏度较低，易受干扰，准确度较低，在基质相对简单的作物上的单个杀菌剂残留分析中发挥着重要作用。质谱法的选择性和灵敏度相对较高，在果蔬、谷物、茶叶、中药材、饮料、肉类等复杂基质的多残留分析中发挥着主要作用。复合蔬果汁基质相对于一般的植物源、动物源基质酸性较大，含水量较高。本研究采用SPE净化技术与LC-MS/MS结合，建立了一种快速、灵敏地检测复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶虫脒和哒螨灵残留的定量分析方法。

1 实验步骤

1.1 仪器与试剂

SHIMADZU 8050液相色谱-串联质谱仪（日本岛津公司）；漩涡振荡器(德国海道尔夫公司)；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；超纯水仪（美国密理博公司）；电子天平(梅特勒-托利多仪器(中国)有限公司)；氮吹仪（美国Organomation公司）。

色谱级乙腈、二氯甲烷、甲醇（德国默克公司）；色谱级甲酸（美国西格玛公司）；SPE-NH2固相萃取柱（美国安捷伦公司）；分析纯乙酸、无水硫酸镁、无水乙酸钠（广州化学试剂厂）。尼龙滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、哒螨灵(pyridaben)和啶虫脒(acetamiprid)标准品浓度为1000mg/L(纯度≥99.0%)，购置于农业农村部环境保护科研监测所。

复合蔬果汁购于本地超市。分别以番茄，芒果和橙子作为基底液的3种复合蔬果汁，在外观颜色上分别呈现红色、黄色、橙色。

1.2 样品的提取以及净化

提取：称取10.00 g样品，用20m L酸化乙腈溶液（含体积分数1%乙酸），涡旋振荡5m in进行提取，后加入4.00 g无水硫酸镁、2.00 g无水乙酸钠，再次涡旋振荡2 m in；以4500 r/m in离心5 m in[19]，取上清液10 m L于另一干净离心管中，氮吹至净干，使用2m L二氯甲烷-甲醇（体积比95:5）混合液复溶，等待下一步净化。

净化：首先采用4m L二氯甲烷-甲醇（体积比95:5）混合液对所使用的SPE-NH2净化柱进行活化，当溶剂液面达到净化柱吸附层表面时，且溶剂未完全流净时，加入提取待净化溶液，用4m L二氯甲烷-甲醇（体积比95:5）混合液洗涤离心管后，再次对SPE-NH2净化柱进行洗脱，重复2次，收集洗脱液，用氮气吹收集到的洗脱液至近干，用乙腈定容到5m L，使用尼龙滤膜过滤后，等待仪器测定。

1.3 LC-MS/MS条件

色谱柱：岛津Shim-pack XB-18色谱柱(2.1mm×50mm,2.6μm)。液相色谱及串联质谱仪器条件[19-20]见表1；吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒的质谱检测参数见表2。

表1 LC-MS/MS条件

表2 吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒的质谱检测参数

1.4 标准溶液配制及标准曲线的绘制

将吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒标准溶液，用适宜溶剂配制成储备液，-20℃保存备用。由于3种目标物在所用仪器的灵敏度不同，因此分别使用经测定不含目标化合物的复合蔬果汁基质溶液将吡唑醚菌酯和哒螨灵配制为 0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列标准溶液；将啶虫脒配制为0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.0 mg/L系列标准溶液，以1.3节所述仪器条件进行检测，以各待测目标化合物的定量离子响应值为纵坐标(y)，以对应的质量浓度为横坐标(x)得到各目标化合物的标准曲线[21]，以便得到3种待测物的线性方程以及相关系数(R2)。

1.5 正确度和精密度

称取经测定不含吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒的复合蔬果汁样品10.00 g，使用标准溶液储备液进行0.010、0.10和0.50mg/kg 3个浓度的添加[21]，每个添加浓度重复6次。涡旋混匀后，按照1.2节所述条件进行样品前处理。计算各添加浓度平均回收率及相对标准偏差(RSD)，用以考察方法的正确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂优化

介于3种复合蔬果汁组成上的差别，致使不同复合蔬果汁在组成成份以及pH值存在一定的差异。试验采用乙腈和酸化乙腈进行了提取溶剂优化。结果如图1所示：使用乙腈提取时，吡唑醚菌酯的回收率为88.5%～118.6%，RSD为3.6%～16.0%；哒螨灵的回收率为97.4%～111.6%，RSD为4.5%～15.7%；啶虫脒的回收率处于73.1%～125.6%之间，RSD为7.3%～13.4%；使用含1%(v%)乙酸的乙腈溶液提取时3种农药的回收率在87.5%～106.8%之间，RSD为1.3%～9.5%，回收率以及相对标准偏差均优于使用乙腈的提取效果。分析其原因，可能是由于提取液中所含有的乙酸与后续提取中所加入的无水乙酸钠形成了一个缓冲体系，稳定了提取体系的同时对目标物的提取也产生了一定的促进作用，确切原因需要进一步的研究考证。

图1 不同提取溶剂对不同复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、哒螨灵、啶虫脒的提取效果影响

2.2 SPE柱洗脱液的优化

基于3种复合蔬果汁成分以及pH上的差异，试验对比了采用氨基SPE柱进行样品净化时，分别使用二氯甲烷-甲醇和乙腈-甲苯作为洗脱液时对3种农药回收率的影响。结果如图2所示：使用二氯甲烷-甲醇为洗脱液时3种被试物的回收率为87.5%～106.8%，RSD为1.3%～9.5%；采用乙腈-甲苯为洗脱液时3种被试物的回收率为67.8%～119.9%，RSD为0.6%～14.5%。相比之下二氯甲烷-甲醇为洗脱液时3种被试物的回收率及RSD相对稳定。本研究中最终使用二氯甲烷-甲醇为洗脱液，氨基SPE柱进行样品净化。

图2 不同洗脱溶剂对不同复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、哒螨灵、啶虫脒的洗脱效果影响

2.3 线性方程、检出限和定量限

使用1.4节所述方法配制吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒系列梯度基质匹配标准溶液，得到3种目标化合物的线性方程。结果表明（表3）：吡唑醚菌酯和哒螨灵在0.001～0.50mg/L、啶虫脒在0.005～1.0mg/L范围内，3种目标化合物线性关系良好，相关系数(R2)在0.9984以上。定量限(LOQ)为最低添加浓度0.010mg/kg。

2.4 正确度和精密度

用复合蔬果汁空白基质分别添加0.01、0.10、0.50mg/kg 3个浓度的上述3种农药，以测定方法的正确度和精密度。按照1.2节方法进行前处理，1.3节方法进行测定，试验结果表明（表3）：添加0.010、0.10、0.50mg/kg 3个浓度时，3种目标农药的平均回收率、相对标准偏差(RSD)分别介于80.6%～113.4%、0.5%～9.3%之间，可以满足复合蔬果汁中目标农药的定性、定量分析要求[22]。

2.5 基质效应

为了提高目标化合物的测定准确度，需要对不同基质产生的基质效应作出评价，并选择合适的方法减小基质效应的影响。本研究采用基质效应=（基质匹配标准溶液响应-纯溶剂标准溶液响应）/纯溶剂标准溶液响应×100[23]的方式对试验中所产生的基质效应进行了评价。在0.10mg/L时，3种农药在3种复合蔬果汁中的基质效应，结果见表3：吡唑醚菌酯在3种复合蔬果汁中都表现出基质增强效应，且3种蔬果汁中的差异相对较大，其中橙汁为基底液的复合蔬果汁中表现最强，达到56.8%。哒螨灵在3种复合蔬果汁中既有增强效应也有减弱效应，番茄、芒果为基底液的复合蔬果汁中表现出较弱的基质减弱效应-2.1%～-4.0%；而橙汁为基底液的复合蔬果汁中则表现出基质增强效应24.2%。啶虫脒在3种复合蔬果汁中既有增强效应也有减弱效应，番茄、芒果为基底液的复合蔬果汁中表现出较强的基质减弱效应-56.0%～-54.0%；而橙汁为基底液的复合蔬果汁中则表现出基质增强效应14.2%。分析发现，3种农药在橙汁为基底液的复合蔬果汁中均表现出基质增强效应。在番茄、芒果为基底液的复合蔬果汁中则有所不同，分析是否与基质的成分以及酸碱度(pH)有关，或者其他可能的原因需进一步研究分析确证。因此为保证定量结果的准确性，本论文中采用基质匹配标准溶液对数据进行校准，进而消除基质效应对检测结果的影响。

表3 复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒残留测定方法确认(n＝6)

3 讨论与结论

本研究建立了LC-MS/MS同时测定复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒残留的方法。目前文献中对这3种目标物的残留测定主要集中于蔬菜、水果等初级农产品以及土壤中，对于加工后农产品的报道相对较少。因此，本方法建立的在酸性较强且含水量较高的基质中同时测定吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒3种不同种类农药残留的方法在一定程度上弥补了这个空缺。同时，本研究中的目标物是目前农业生产中常用的3种杀菌剂、杀螨剂、杀虫剂，对后续相似基质中同类目标物的残留分析提供一定参考数据。

本研究中的基质酸性较强且含水量较高，对于一些酸不稳定的残留物来说，在酸性条件下是否会产生代谢产物，这些代谢产物是否也同样会对人体健康产生一定的潜在危害，是否需要一并测定，需进一步进行研究讨论。因此，使用该方法时可以根据目标物在酸性环境是否会产生代谢物进行考虑，必要时可对相关代谢物也一并进行测定。本研究是否适用于在酸性条件下不稳定易降解的目标物，本文并没有进一步进行研究，这也需进一步进行验证。同时，基于风险评估的角度，单个农产品的摄入，对人体健康产生的风险，与同时摄入多种农产品产生的风险也存在差异。同时摄入多种农产品产生的风险，可能会产生叠加效应，因此需进一步进行探讨。

本研究通过优化样品提取和净化方法，建立了LC-MS/MS同时测定复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒残留的方法。本方法提供了在酸性较强且含水量较高的基质中同时测定吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒3种不同种类农药残留的方法，采用基质匹配标准溶液对数据进行校准，从而有效降低了检测过程中串联质谱所产生的基质效应对检测结果准确度的影响。样品前处理相对简便、检测灵敏度高，方法的线性关系在0.9984以上、在添加浓度为0.010、0.10和0.50 mg/kg时，3种目标物的回收率为80.6%～113.4%；相对标准偏差(RSD)介于0.5%～9.3%之间，正确度和精密度等指标均可满足农药残留检测的要求[22]，该方法适用于复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、哒螨灵和啶虫脒等同类农药残留的同时检测分析。