胰腺导管腺癌重要驱动基因突变与临床病理特征、预后间相关性的分析

谢吻，梁怀予，董磊，袁菲，王朝夫，郭 滟

（上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科，上海 200025）

胰腺癌是一种高侵袭性、高死亡率的消化道恶性肿瘤，患者起病隐匿、病情进展迅速，多数患者就诊时往往已处于局部晚期或已发生肿瘤远处转移，预后极差。据2015 年国家癌症中心报道，胰腺癌是目前国内第六大肿瘤相关死因，每年约有9 万例新增胰腺癌患者和8 万例死亡患者，预计在未来几年内其发病率与死亡率仍将呈上升趋势[1]。有学者预计到2030年，胰腺癌甚至将上升成为全球第二位恶性肿瘤致死原因[2]。胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是胰腺最常见，也是预后最差的恶性肿瘤，患者的5 年总生存率仅为5%～8%[3]。近年来，基于基因测序技术的胰腺癌分子生物学研究进展较多，逐渐改变了人们对胰腺癌发生机制的了解及临床诊疗方案的选择[4]。一般认为，PDAC 的发生、发展过程中往往伴随着多个基因的改变和积累。其中，癌基因KRAS 的活化，抑癌基因TP53、CDKN2A 的失活，以及SMAD4 的缺失是公认的较常见也是较重要的驱动基因突变，其已被证实在胰腺癌的发生、发展中发挥关键作用。而其他基因则多为低频突变，如ATM、BRAF、GNAS、RNF43、BRCA1/2[5]。这些突变基因（尤其是KRAS）往往可以提供有关PDAC 患者疾病进展及生存的独特信息，协助制定合理的分子靶向治疗策略及研发新的特异性靶向药物，改善患者预后[6-7]。

目前，国内外针对这4 个重要驱动基因（KRAS、TP53、SMAD4 及CDKN2A）的遗传状态与临床病理特征之间关系的研究尚少，且产生了相互矛盾的结果[8-12]。本研究利用靶向测序技术检测了269 例PDAC 患者的相关基因突变，并分析4 种重要驱动基因突变及其与临床病理特征之间的关系，为临床个性化治疗及预后评估提供更多理论依据和线索。

材料与方法

一、一般资料

本研究纳入2018 年5 月至2019 年9 月于上海交通大学医学院附属瑞金医院接受手术切除并经术后病理明确诊断为PDAC 的患者。本研究的纳入标准为符合以下所有条件：①于我院接受胰腺外科手术切除；②经术后病理确诊为原发性胰腺导管腺癌并对肿瘤组织进行第二代测序（next generation sequencing，NGS）检测。本研究的排除标准为符合以下任意一项：①胰腺神经内分泌肿瘤、腺鳞癌等其他组织学类型的胰腺恶性肿瘤；②术前接受新辅助化疗或其他生物免疫治疗；③因其他原因死亡；④临床病理或随访资料缺失。最终有269 例PDAC患者被纳入本研究。

二、方法

1.临床资料：收集患者的临床资料，分类整理各项临床病理特征，包括性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分化程度、神经侵犯、脉管内癌栓、病理T 分期、病理N 分期、远处转移及临床分期（根据第8 版美国癌症联合委员会胰腺癌分期系统），以评估患者术时的基本情况和疾病状态。

2.随访：采用门诊信息采集及电话形式对患者进行随访。生存时间以月计算，起点为就诊后手术日期，主要终点为死亡日期，次要终点为末次随访日期或者末次门诊就诊日期。随访时间截至2020 年7 月。

3.基因突变检测：所有手术切除标本均在离体后30 min 内切取待检组织，放入液氮罐中，送至实验室。经病理学检查结果证实为PDAC 组织，并保证肿瘤细胞含量>20%后，进行DNA 提取。通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的浓度、纯度及完整性。如质检合格，制备DNA 文库用于文库构建并定量，然后使用Illumina 测序平台进行靶向捕获测序（包括KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A 等肿瘤相关基因566 个）[13]，依据GATK 最佳实践流程（https://software.broadinstitute.org/gatk/best-practices/）对测序数据进行体细胞突变分析，包括点突变以及小片段的插入/缺失。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，分类变量以例数表示，χ2检验和Fisher 精确概率法用于评估PDAC 各重要驱动基因突变状态与临床病理特征的关系；经Kaplan-Meier 单因素分析（Log-rank 检验法）后，将其中组间差异有统计学意义的变量纳入含4 个重要驱动基因突变状态及基因突变个数的COX 比例风险回归模型，进行多因素生存分析。P 值均基于双向假设检验，P<0.05 视为差异有统计学意义。

结果

一、临床病理特征

269 例PDAC 患者的临床病理特征见表1。男女发病比例约为2∶1；发病年龄为37～84 岁（中位发病年龄为62 岁）。术后病理学检查结果显示，肿瘤最大径为1.0～9.5 cm（平均3.6 cm）；低分化肿瘤31 例（11.52%）；有神经侵犯255 例（94.80%）；有脉管内癌栓104 例（38.66%）；TNM 分期中，Ⅰ期及Ⅱ期为190 例（70.63%），Ⅲ期及Ⅳ期为79 例（29.37%）。

表1 269 例PDAC 患者的临床病理特征

二、重要驱动基因突变特点

269 例PDAC 患者中，重要驱动基因KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A 突变分别有222 例（82.53%）、148 例（55.02%）、41 例（15.24%）、30 例（11.15%）（见表2）。269 例患者中有40 例未检出重要驱动基因突变，71 例发生单基因突变，158 例发生多基因共突变，其中6 例是4 种基因共突变，42 例是3 种基因共突变，110 例是双基因突变。

另外，222 例KRAS 突变中，67 例为KRAS 单一基因突变，155 例为多基因共存突变；突变类型均为错义点突变，主要位于第2 号外显子，其次是第3 号外显子；第2 号外显子中，GI2D、G12V、G12R、GI2C、GI2L的突变率分别为42.3%（94/222）、37.84%（84/222）、12.16%（27/222）、1.80%（4/222）、0.45%（1/222）；第3 外显子中，G61H 突变10例，Q61L 突变1例，Q61R 突变1 例。而TP53、SMAD4及CDKN2A 这3 个基因的突变位点较为分散，且类型复杂多样，难以统计。

三、重要驱动基因突变状态与临床病理特征的关系

269 例PDAC 患者中（见表2），对222 例KRAS基因突变、148 例TP53 基因突变、41 例SMAD4 基因突变、30 例CDKN2A 基因突变与各项临床病理特征的关系进行分析后发现，KRAS 基因在>70 岁的PDAC 患者中的突变率明显高于≤70 岁的患者，其突变率分别为93.75%（45/48）、80.09%（177/221），提示KRAS 基因突变状态与患者年龄有关（χ2=5.103，P=0.024）；TP53 基因在低分化肿瘤患者中的突变率明显高于中、高分化肿瘤患者，其突变率分别为74.19%（23/31）、52.52%（125/238），提示TP53 基因突变与肿瘤分化程度相关（χ2=5.206，P=0.023）。SMAD4、CDKN2A 基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分化程度、神经侵犯、脉管内癌栓、病理T 分期、病理N 分期、远处转移及TNM 分期均无关（P>0.05）。

表2 269 例PDAC 患者重要驱动基因突变状态与临床病理特征间的关系[例（n）]

四、重要驱动基因状态与预后的关系（见表3）

表3 269 例PDAC 患者重要驱动基因突变状态与预后的关系分析结果

269 例PDAC 患者中，260 例获得术后随访，9 例失访，随访时间为1～26 个月。单因素分析结果显示，与PDAC 患者预后相关的临床病理因素有神经侵犯、脉管内癌栓、病理T 分期、病理N 分期、TNM 分期及术前CA19-9（P<0.05），而TP53突变的PDAC 患者的总体生存时间更短（P=0.045）。

将上述单因素分析中有预后价值的临床病理特征，纳入含4 个重要驱动基因突变状态及基因突变个数的COX 回归模型后，发现TP53 突变是影响PDAC 患者术后生存的独立危险因素 [HR=4.30（1.32～14.04），P=0.016]，其余基因突变状态与患者预后均无相关性。

讨论

胰腺癌的发生、发展受多基因调控，其中KRAS 突变是发生最早的遗传事件，紧接着是CDKN2A 突变，TP53 和SMAD4 突变相对来说发生时期较晚，一般存在于PanIN-3 及浸润性癌中，而这4 种驱动基因突变状态对PDAC 发生和进展的重要性已经得到大量基因组学研究的证实[14]。PDAC 的分子分型研究亦为临床诊疗和预后评估带来了新的契机[15-16]，其重要驱动基因突变状态更是与患者预后及临床病理特点密切相关。例如，有研究认为，KRAS、TP53、SMAD4 和CDKN2A基因中存在2 个以上突变的胰腺癌患者的中位生存时间显著短于野生型患者[10]。但也有研究表明，在长期生存的胰腺癌患者中，这4 个基因的突变情况与普通胰腺癌患者并无差异[12]。目前这些相关数据多来源于欧美人群，且部分研究结论相互冲突，尚未在国内外达成共识。因此，对更多PDAC 患者特别是国内PDAC 患者的重要驱动基因突变特点及其与临床病理学因素、预后间的关系进行分析显得尤为重要。

一、KRAS 基因突变与临床病理特征之间的关系

原癌基因KRAS 位于人类12 号染色体的p12.1区，可以通过活化MAPK 和（或）PI3K 通路调控细胞的生长、增殖、分化、凋亡等重要生命活动，从而促进肿瘤形成和发展[17]。

1.KRAS 基因突变率高且2 号外显子突变最常见：既往文献显示，KRAS 基因在PDAC 中的突变率高达70%～95%，且突变常位于第2 号外显子的12、13 位密码子和第3 号外显子的61 位密码子突变[18]。本研究中，PDAC 患者的KRAS 基因突变率为82.53%（222/269），绝大多数位于第2 号外显子的12 位密码子（94.59%），其氨基酸改变主要为G12D（42.3%）和G12V 突变（37.84%），与既往研究结果基本一致[19]。而具有KRAS 基因突变的肿瘤患者可对分子靶向药物EGFR-TKI 原发性耐药，治疗选择进一步受限，尝试开发新的KRAS 靶向药物迫在眉睫。

2.高龄患者更常出现KRAS 基因突变：本研究还发现，KRAS 基因突变与患者年龄有关（P<0.05），>70 岁PDAC 患者的KRAS 基因突变率（93.75%，45/48）显著高于≤70 岁的患者（80.09%，177/221），而与其他临床病理特征无关联。手术联合化疗是胰腺癌患者目前最主要的治疗手段，但其预后改善效果并不明显，尤其高龄患者对手术和化疗的耐受性较差，更是无法从中得到较大生存获益。而新兴的分子靶向治疗虽尚未取得重大突破，却有研究[20]发现，外泌体可特异性靶向治疗胰腺癌中的KRAS 突变，在多种胰腺癌小鼠模型中抑制癌症，并显著提高其总生存率。因此，根据本研究结果（>70 岁患者中KRAS 基因突变率更高），外泌体治疗或可为高龄PDAC 患者生存期的延长及生存质量的改善提供一个新的方向。

二、TP53 基因突变与临床病理特征之间的关系

抑癌基因TP53 位于人类第17 号染色体p13.1区，编码p53 蛋白，可通过调节靶基因的表达诱导细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA 修复或代谢改变，参与多种癌症的发生、发展[21]。既往研究表明，胰腺癌患者中TP53 基因的突变率为55%～75%，其突变主要表现为p53 蛋白缺失，从而导致胰腺癌中调节细胞死亡及分化的2 条重要途径出现异常[8]。本研究PDAC 患者的TP53 基因突变率为55.02%（148/269），与既往文献报道吻合。TP53 作为PDAC 常见的肿瘤抑制基因，是一个潜在有效的治疗靶点。

1.低分化患者更常见TP53 基因：有研究显示，TP53 基因突变与肿瘤分化程度及切缘相关[11]。同样与之相符的是，本研究中低分化PDAC 患者的TP53 基因突变率为74.19%（23/31），显著高于中、高分化患者52.52%（125/238），提示TP53 基因突变可能更易发生于低分化肿瘤患者（P<0.05）。目前，TP53 基因可作为临床预测化疗反应的候选基因，其突变失活可能导致肿瘤患者对铂类化疗药物产生抵抗[22]。因此，临床实践中需要在TNM 分期的基础上进一步判断肿瘤的异质性，针对不同分化程度的PDAC 患者采取特定的治疗策略，以更好地预测及改善患者的预后。

2.TP53 基因出现突变提示预后更差：研究表明，TP53 基因的突变状态与胰腺癌患者的生存密切相关，长期生存的胰腺癌患者中TP53 突变率更低[23]。而本研究发现，TP53 突变是影响PDAC 患者术后生存的独立危险因素，进一步佐证了上述结论，为将来临床可能将TP53 突变作为预测患者预后的参考指标提供了更多的证据。

三、SMAD4、CDKN2A 基因突变与临床病理特征的关系

本研究还探讨了PDAC 患者肿瘤组织中抑癌基因SMAD4、CDKN2A 基因的突变特点，及其与患者临床病理特征间的关系。其中，SMAD4 基因是TGF-β 信号通路的信号分子之一，可以通过抑制细胞生长从而发挥抗肿瘤作用，但在PDAC 中常由于体细胞突变而导致表达缺失，从而丧失对TGF-β 生长抑制功能的敏感性，增强肿瘤细胞的侵袭性和转移风险[24]。而CDKN2A 基因可以通过控制细胞周期，抑制CDK4/6 介导的Rb 磷酸化，抑制G1/S 期的转变，其突变或启动子甲基化后均可导致p16 蛋白失活，从而引起细胞周期失控最终出现过度增殖[25]。研究显示，西方人群的PDAC 患者中，SMAD4、CDKN2A 基因突变率分别为20%～55%、20%～40%[5-6,14]。本研究PDAC 患者的SMAD4、CDKN2A基因突变率分别为15.24%（41/269）、11.15%（30/269），略低于既往研究结果。这可能是由于不同种族及地域人群中基因突变率存在着一定的差异。本研究还发现，SMAD4、CDKN2A基因突变则与PDAC患者的年龄、性别、TNM 分期等临床病理特征及预后无关（P>0.05），与部分文献报道[11]基本一致。但也有相关研究[9]显示，SMAD4 表达缺失与肿瘤大小、淋巴结转移及淋巴管浸润密切相关，CDKN2A 表达缺失与淋巴管浸润及远处转移相关，同时SMAD4 和CDKN2A 的缺失还与PDAC 患者较短的总生存期显著相关。出现这种差异的可能原因为选择了不同的研究方法，上述研究采用的是免疫组化检测，在蛋白水平上呈现的结果与真实的基因突变状态间可能存在差异，而本研究采用的靶向测序则可直接在基因水平上体现出SMAD4、CDKN2A 基因突变状态与临床病理特征之间的相关性，但也不排除受到了样本选取、实验操作等因素的影响，故有待扩大样本量并优化研究方案进一步分析。

综上所述，本研究通过单中心较大样本量的靶向测序研究统计分析了PDAC 患者相关基因突变特点，结果发现KRAS 突变率最高，其次是TP53、SMAD4、CDKN2A，为以后多中心大样本量研究及基因库的建立提供了数据支持。同时，本研究分析了PDAC 患者重要驱动基因突变状态与临床病理特征间的关系，发现KRAS、TP53 突变分别与患者年龄及肿瘤分化程度相关，且TP53 突变型患者的预后更差，有助于临床选择合适的基因检测人群及合理的治疗方案，以更好地预测患者的预后，提高生存率。由于本研究随访时间较短，期待在后续研究中继续跟踪随访，并对更多不同地域及更大数据量的样本人群进行深入研究，以更准确地反映PDAC 重要驱动基因突变状态的临床病理、预后预测及治疗反应价值，进一步细化PDAC 重要驱动基因突变的人群特征，在临床实践中为患者制定更全面、精确的个体化治疗策略，改善其生存质量。