西双版纳与海南橡胶林根际细菌群落组成与多样性研究*

杜昊楠，魏亚情，全飞， 陈伟，兰国玉,3 ，吴志祥,3

(1.海南大学 热带作物学院，海南 海口 570228;2.中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 海口 571101;3.农业农村部儋州热带作物科学观测实验站，海南 儋州 571737)

根际微生物对植物十分重要，有研究表明，土壤微生物群落对植物的影响大于土壤理化性质，突出对特定根际土壤微生物研究的重要性，因为植物选择可能对调节微生物群落、影响作物产量等功能方面有相互作用[1]，作物产量依赖植物与植物根部联系的微生物之间的密切联系。根际细菌和真菌不同于土壤其余部分的微生物群落，对植物养分吸收和健康更为重要[2]，特定的植物物种对微生物群落也有影响，每个植物物种的根际都蕴藏着核心微生物和独特的微生物，它们的相对丰度和组成是不同的[3]。根际土壤是指附着在根系附近土壤理化性质和生物性质与原来土体不一样的区域内的土壤，根际土壤中存在大量微生物，即根际微生物[4]，根际微生物可以反映出土壤的结构质量和土壤的肥力等性质，对于植物也具有重要的作用，比如促进植物对于养分的吸收，增强植物的抗逆性，促进植物的生长，提高作物的产量[5]。

天然橡胶是在国防和工业中重要的战略物资[6]。兰国玉等人[7-12]对橡胶(Heveabrasiliensis)林土壤微生物群落做了深入研究，表明海南和西双版纳的橡胶林其土壤细菌群落存在显著差异。对橡胶树根际土壤微生物进行的研究，开展了不同耕作(施肥、间作、栽培等)模式下橡胶人工林土壤微生物生物量、土壤酶活性以及土壤微生物群落结构等涉及土壤肥力与健康状况方面的研究[13]。马萍等[14]对西双版纳橡胶根际土壤的放线菌区系进行研究，发现链霉菌(Streptomyces)的分离频率最高，且分离频率旱季高于雨季。

西双版纳属于热带季风气候，该地区橡胶林属于热带内陆静风区种植类型，而海南属于海洋性热带季风气候，该地区橡胶林属于热带岛屿型种植区类型。云南和海南是我国两大橡胶基地[15]。橡胶林根际细菌群落的多样性在大尺度地理位置是否发生显著变化，是受何种影响的并不清楚。目前国内对于大尺度空间分布下不同地区植物根际微生物的研究较少，对西双版纳地区和海南地区橡胶林根际微生物的比较研究未见报道，对于橡胶林根际微生物研究多为单一地区人工种植下的植胶区，比如海南儋州的研究，探索大尺度地理分布是否造成了橡胶林根际土壤微生物多样性的变化、不同取样位置的环境因素是否造成了土壤微生物组成的相异性，可以为海南与云南西双版纳橡胶林土地的管理和保护，以及对于橡胶林土壤微生物的其他研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区自然概况

海南岛面积3.54×104km2(18°10′～20°10′N,108°37′～113°3′E)，属于热带季风气候，年平均降雨量为1 750 mm[16]。

西双版纳傣族自治区位于云南省最南部(21°08′～22°36′N,99°56′～101°50′E)，面积19 690 km2,为热带季风气候，年平均温度23.6 ℃，年平均降雨量为1 750 mm[17]，是中国生物多样性最丰富和国际生物多样性的热点地区之一。

1.2 研究方法

1.2.1 样地设置与基本情况

海南地区在儋州、万宁、乐东等3个地区的植胶区各选取1个取样点，西双版纳地区分别在景洪县、勐腊县、勐仑镇等3个地区的植胶区各选取1个取样点。每个取样点选取3块样地，每个样地均设置1块20 m × 20 m的标准样方。

1.2.2 样品采集

每个样地均设置1块20 m × 20 m的标准样方。以橡胶树树干为圆心，0.5 m为半径，去除枯枝落叶层和表层5 cm的土壤，采集5～20 cm土壤层的土样200 g，每个样地采取多点取样(每株橡胶树取3个方向，并将每个样点同一土层的土壤混合均匀为一个样本)，用铁铲和小铲子配合完成。用镊子挑去里面的杂物和树根，采集500 g土装袋封存，在野外放入冰盒(4 ℃)里，用于理化性质检测，贴上标签，迅速带回实验室，风干，过2 mm筛后低温(4 ℃)储存，风干做土壤养分分析。先将橡胶树根系从5～20 cm土层土壤中挖出,分别剪取5～8根直径2 mm以内细根系，每根根系长约9～12 cm(尽量不要碰伤表皮)，抖掉与根系松散结合的土壤，将与根系紧密结合在0～5 mm范围的土壤使用无菌刷子刷下来，放入无菌自封袋里，每个点收集5～10 g作为根际土壤,再装入10 mL的离心管，20目筛网过筛处理，然后将3个土样混合均匀，取5～10 g保存于无菌离心管中，在野外放入冰盒里，运回实验室后尽快放入-70 ℃冰箱进行保存，用于微生物的分离及分析。

1.2.3 样品分析和数据处理

(1)土壤理化性质测定

土壤理化性质指标的测定采用常规分析法[18]。土壤水分采用重量法测量；土壤pH值采用酸度计电位法(在1︰2.5的土水比溶液中);有机质含量采用高温外热重铬酸钾氧化-容量法；硝态氮测定采用水蒸气蒸馏法，铵态氮测定采用靛酚蓝比色法；速效磷含量采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法；速效钾含量采用醋酸铵浸提-火焰光度计法;全氮含量采用纳氏比色法，全磷含量采用钼锑抗比色法；全钾含量采用火焰光度计法。每份样品各项指标重复测定 3 次。

(2)高通量测序

土壤DNA提取 使用E.Z.N.A.S土壤DNA试剂盒(Omega Bio-Tek，诺克罗斯，佐治亚州，美国)从0.5克新鲜土壤中提取微生物DNA。

测序进行PCR 扩增时引物选择 检测细菌选择引物为515FmodF(5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’)and 806RmodR(5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’)[19-20]。

有效序列数据及优化序列数据 从2%琼脂糖凝胶中提取Illumina MiSeq测序扩增片段，并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.)进行纯化，并使用QuantiFluorTM-ST(Promega，U.S.)进行定量。纯化的扩增产物按等摩尔比混合，并在Illumina MiSeq平台上按标准方案进行成对末端测序(2×250)。

(3) 数据分析

使用Uparse软件[21](版本7.0.1090，http://www.drive5.com/uparse/)基于 97% 的相似度[21-22]对所有细菌序列进行OTU聚类分析。RDP Classifier软件[23](版本2.11，https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)进行序列分类注释，对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库(version 138)，设置比对阈值为70%。Mothur软件(版本1.30.2，https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)进行alpha多样性分析。 Qiime软件(版本1.9.1，http://qiime.org/install/index.html)生成各分类学水丰度表并进行beta多样性距离计算。R语言(version 3.3.1)进行主坐标分析(PCoA)统计分析和作图。R语言vegan包进行环境因子冗余分析(RDA)分析和作图。

2 结果与分析

2.1 稀释性曲线分析

在OUT的水平下，以样本的Alpha多样性指数Sobs指数值为纵坐标绘制曲线，发现当细菌达到55 000条时，曲线有趋向平坦趋势，说明样本微生物群落的检测比率接近饱和，目前的测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种。西双版纳和海南地区橡胶林根际微生物的稀释曲线，反映了在多个样本中，西双版纳地区橡胶林根际微生物多样性较海南高。

图1 细菌16S 稀释性曲线Fig.1 Bacterial 16s rarefaction curve

2.2 西双版纳与海南岛橡胶林土壤细菌群落组成

在两种根际土壤类型中，图2结果表明不同样本在门和纲水平优势物种相同，但相对丰度不同。门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、 绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)是优势菌门，而在西双版纳根际土中， 变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度(31.54%)显著高于海南(22.24%)，海南的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度(26.26%)极显著高于西双版纳(3.15%)。纲水平上，芽孢杆菌纲(Bacilli)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteriashi)是优势菌纲，其中，海南的根际土中芽孢杆菌纲(Bacilli)的相对丰度(26%)极显著高于西双版纳(2.98%)。除个别优势菌门和菌纲存在显著性差异外，大部分低丰度物种相对丰度相似。

图2 西双版纳地区与海南地区橡胶林根际细菌群落组成注：左为门水平、右为纲水平Fig.2 Composition of bacterial community in the rhizosphere of rubber Forest in Xishuangbanna and Hainan

2.3 西双版纳与海南地区橡胶林根际细菌群落Alpha多样性

对海南地区和西双版纳样本细菌群落多样性指数进行分析，结果见图3。

图3 西双版纳地区与海南地区橡胶林根际细菌多样性指数差异Fig.3 Difference of bacterial diversity index in rhizosphere of H.brasiliensis forest between Xishuangbanna and Hainan

Ace指数和Chao指数可反映群落物种丰富度，在丰富度上，西双版纳地区根际细菌多样性显示都高于海南地区，但Ace指数和Chao 指数不存在显著差异(P<0.05)。Shannon指数和Simpson指数表示样品的均匀度，在均匀度上，细菌群落的Shannon和Simpson指数有显著性差异(P<0.05)。通过Shannon指数组间差异分析发现，西双版纳地区橡胶林根际细菌多样性显著高于海南地区。海南地区Simpson优势度指数高于西双版纳地区，实际上均匀度指数低于西双版纳。整体上看，西双版纳细菌多样性高于海南地区。

2.4 西双版纳地区与海南地区土壤细菌群落结构特征

PCoA分析下西双版纳与海南的根际土壤细菌能够明显分离出来，存在明显的地理分布，Adonis检验得到，西双版纳与海南的地理位置因素对组间差异的解释度为18.15%，地理分布对根际土壤细菌群落组成有很大影响，大尺度地理位置的橡胶树根际土壤细菌群落组成存在明显差异。PC1轴和PC2轴对结果的解释度分别为27.13%和18.35%(图4)。

图4 西双版纳地区与海南地区橡胶林根际细菌群落的主坐标轴(PCoA)分析Fig.4 Principal coordinate(PCoA)analysis of bacterial community in the Rhizosphere of H.brasiliensis forest in Xishuangbanna and Hainan

2.5 西双版纳地区根际土壤独有细菌多样性较高

对西双版纳地区和与海南地区进行Venn图分析，在属水平比较西双版纳和海南橡胶林根际细菌微生物群落中共有和特有的属数量，用于发现大尺度地理分布对根际微生物多样性的影响。结果表明，西双版纳地区与海南地区共有的细菌属有758属，占两个地区所有细菌属种类的78.39%。海南独有的46属，占所有菌属的4.76%；西双版纳独有的有163属，占所有菌属的 16.86%。大尺度地理分布改变了西双版纳和海南地区橡胶林根际土壤细菌在属水平的组成，西双版纳地区根际土壤发现的独有细菌属种类高于海南地区，说明西双版纳地区根际土壤独有细菌多样性较高。

图5 土壤细菌在属水平上的维恩图Fig.5 Venn diagram of soil bacteria at genus level

2.6 西双版纳地区与海南地区土壤环境因子与微生物群落的相关性

由环境因子表(表1)可知，西双版纳和海南地区橡胶林根际土壤细菌的丰度与根际土壤中的有机质(SOM)、全磷(TP)、全钾(TK)具有显著的相关性(P<0.05)。

表1 西双版纳地区与海南地区橡胶林根际细菌环境因子冗余分析解释度Tab.1 Explanatory degree of redundancy analysis of bacterial environmental factors in rhizosphere of H.brasiliensis forest in Xishuangbanna and Hainan

通过环境因子冗余分析(RDA)分析揭示不同地区样本细菌门水平群落组成与不同环境因子之间的相关性。第一轴和第二轴对细菌门丰度总方差的解释率为62.38%(图6)，虽然大多数理化性质对根际土壤细菌的群落组成没有显著影响(P>0.05)，但有机质(SOM)，全磷(TP)，全钾(TK)是显著影响细菌群落组成最主要的环境因子。

图6 西双版纳地区与海南地区橡胶林根际细菌群落组成与环境因子的冗余分析注：RDA分析即冗余分析，是环境因子约束化的PCA分析，又称多元直接梯度分析。图中RDA1(10.49%)和RDA2(51.89%)为主成分解释度Fig.6 Redundancy analysis of bacterial community composition and environmental factors in rhizosphere of H.Brasiliensis forest in Xishuangbanna and Hainan

3 讨论与结论

3.1 讨论

大尺度的空间地理位置会对植物的根际土壤微生物组成造成影响，Xue等[24]对亚热带河流微生物群落构成研究发现，生态系统之间的空间分布和距离可能会影响微生物群落的分布，改变微生物群落的组成。微生物分布的空间模式明显存在。同一季节(雨季)，在门水平上，海南的厚壁菌门丰度和西双版纳具有显著差异，芽孢杆菌纲构成了厚壁菌门的主体，其产生的芽孢增加了微生物的抗逆性，对于微生物适应极端环境有重要的作用[25]。西双版纳地区日平均气温稳定≥10 ℃有效积温都大于7 000 ℃，日平均最高积温则出现在海南岛地区，达到9 000 ℃[26]，由此推测海南岛的积温较高，同时海南岛的土质相对于西双版纳地区偏酸性，微生物为适应海南岛的极端气候使得厚壁菌门的丰度变高，也与本文中纲水平上优势菌纲芽孢杆菌纲丰量海南地区显著高于西双版纳相对应。西双版纳的变形菌门高于海南，和本研究纲水平的物种丰度差异对应——西双版纳与海南地区α变形菌纲和γ变形菌纲都属于变形菌门，也是丰度前5位的优势菌纲，都为西双版纳地区高于海南地区。

对两个地区根际土壤微生物的多样性指数进行对比，其中不管是样品的丰富度指数如Ace指数和Chao指数还是均匀度指数Shannon指数，均显示西双版纳地区高于海南地区。Shannon指数越大，说明群落多样性越高， Shannon指数西双版纳显著高于海南地区。Liu 等[3]的研究也证实了这一点，微生物群落在多个空间尺度上具有重要的空间结构(即微生物群落特征的高空间变异性/异质性不是随机分布在空间中的)，土壤细菌丰富度、均匀度和香农指数存在显著空间差异，土壤性质通过调节土壤生境异质性影响物种数量。通过PCoA分析，进一步证明了大尺度的地理分布是影响橡胶林根际细菌组成的重要因素，与前人结果一致，如：周赛等[27]对于中亚热带毛竹(Phyllostachyspubescens)林微生物土壤的研究表明，毛竹土壤微生物的群落结构在空间尺度上存在显著性差异，随着地理距离的增大，土壤微生物相似度减小；韩冬雪等[28]发现，同一深度的红松(Pinuskoraiensis)林土层微生物多样性随着海拔的升高而降低。由本研究中的Venn图分析可知，西双版纳地区根际土壤细菌多样性高于海南的原因之一可能是因为西双版纳地区根际独有的细菌物种(16.86%)远高于海南地区(4.76%)。黄艺等[29]在对干旱半干旱地区土壤微生物的研究中发现，地理距离对于干旱半干旱区土壤微生物空间分布格局具有显著影响，土壤微生物对于空间分布具有生境依赖性，推测西双版纳和海南岛地区根际土壤独有微生物对于地理位置具有生境依赖性，与前人研究结果一致。

有研究表明土壤微生物地理空间分布受土壤性质、气候、地形和土地利用等影响因素的综合作用，其中土壤特性对微生物分布的贡献最大，使土壤微生物群落在纬度上显示出很强的梯度性，而其他环境因素(如温度、海拔)的影响较小，农业活动减少了微生物群落丰度的变化[30]。本研究中，有机质和全磷全钾是影响西双版纳与海南地区橡胶林根际细菌组成的主要土壤理化性质。有机质是影响土壤中微生物种群数量和生物量的重要因素，有机质含量越高，土壤中微生物种群和生物量积累越高[29]，同时，土壤细菌中的放线菌门和变形菌门与土壤有机质显著正相关[31]，在本研究中，变形菌门和放线菌门是西双版纳地区和海南地区橡胶林根际细菌丰度排在前3位的优势菌门，与前人研究结果相吻合。本研究中全钾是影响土壤细菌空间分布的主要因素，这与魏佳宁等[32]的研究结果相一致。土壤全磷分为有机磷和无机磷，土壤中存在解磷微生物，并且有明显的根际效应，主要由芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌类群组成，芽孢杆菌属是有机磷细菌，假单胞杆菌属既是无机磷细菌也是有机磷细菌[33]。芽孢杆菌属是橡胶林根际土壤中优势菌纲(芽孢杆菌纲)和优势菌门(厚壁菌门)的重要组成成分，假单胞菌是橡胶林根际土壤中优势菌纲γ-变形菌纲和优势菌门变形菌门的重要组成成分，全磷通过影响土壤中的优势物种来影响土壤的微生物组成。

3.2 结论

(1)在西双版纳和海南地区橡胶林根际土壤中，变形菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、酸杆菌门是优势菌门，芽孢杆菌纲、放线菌纲、α-变形菌纲、酸杆菌纲、γ-变形菌纲是优势菌纲。

(2)西双版纳和海南地区橡胶林根际土壤细菌群落多样性差异显著，在均匀度上，西双版纳地区显著高于海南地区。橡胶树根际土壤细菌群落组成在大尺度地理位置上存在明显差异，西双版纳地区根际独有细菌属的比例较高。

(3)有机质、全磷、全钾是显著影响细菌群落大尺度地理分布最主要的理化性质。