危害不同寄主云斑白条天牛不同世代线粒体CO I基因的序列比较*

梅增霞，李建庆，尚帅，杨洁，常志恒

(1.滨州学院 生物与环境工程学院 山东省黄河三角洲生态环境重点实验室，山东 滨州 256603；2.中国林业科学研究院 森林生态环境与保护研究所，北京 100091)

云斑白条天牛(Batoceralineolata)，属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)的林业蛀干害虫，在黄河三角洲地区主要危害白蜡树(Fraxinuschinensis)，在洞庭湖地区主要危害杨树，以幼虫危害树干木质部为主[1-3]。危害白蜡树和杨树的云斑白条天牛种群由于长期地理隔离和食性差异，伴随着对不同环境和食物的适应，这两个种群的形态结构和生态习性也不断适应进化，其遗传结构也会随时间的变化相应地发生变化。

线粒体基因较为保守，不易突变，是研究昆虫种群系统发育与进化的理想材料，COI基因广泛应用于蝽科(Pentatomidae)、栗瘿蜂(Dryocosmuskuriphilus)、柑橘果实蝇(Bactroceraspp.)等多种昆虫系统进化研究[4-6]。有关云斑白条天牛线粒体COI相关研究较少，仅见Wang等[7]分析了云斑白条天牛成虫的线粒体全基因组序列及其编码的蛋白，禹海鑫等[8-9]利用COI基因分析比较了白条天牛属10种天牛的系统发育情况，梅增霞等[10]比较了危害杨树的云斑白条天牛雌雄成虫线粒体基因的变化差异。以上研究发现线粒体基因在云斑白条天牛同一种群内部的雌雄个体之间存在一定差异，但有关云斑白条天牛种群不同发生年度世代间线粒体基因变化的研究一直未见报道；因此，本研究以2014年和2019年采集云斑白条天牛成虫作为不同发生年度的世代个体，分析比较南方危害杨树种群和北方危害白蜡树种群的雌、雄成虫不同年度世代个体间的线粒体COI基因序列差异及变化情况，为研究云斑白条天牛的种群进化提供案例和参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2014年度世代云斑白条天牛成虫中，危害白蜡树种群于2014年6月采自山东滨州，危害杨树种群于2014年5月采自湖南岳阳；2019年度世代云斑白条天牛成虫中危害白蜡树种群于2019年6月采自山东滨州，危害杨树种群于2019年5月采自湖南岳阳。

1.2 线粒体CO I基因的扩增

云斑白条天牛成虫DNA提取和线粒体COI基因的PCR扩增方法同梅增霞和李建庆[10]。

1.3 不同年度世代个体CO I基因序列比较

将获得COI基因序列，利用DNAStar的Editseq程序，统计分析不同基因序列的碱基组成，查找开放阅读框(ORF)以及翻译的氨基酸序列，统计碱基含量。利用MegAlign程序，分析序列相似度差异。

2 结果与分析

2.1 CO I基因碱基含量比较

将2014年和2019年危害白蜡树和杨树的云斑白条天牛雌、雄成虫的COI基因扩增并测序，结果见表1。

表1 不同年度世代云斑白条天牛成虫CO I基因碱基长度比较Tab.1 Base length comparison of CO I genes of different year generation adults of B.lineolata

由表1可见，序列拼接后，获得危害白蜡树云斑白条天牛雌、雄成虫2014年和2019年世代的COI序列，长度在699～709 bp之间，危害杨树云斑白条天牛的序列长度在663～713 bp之间。为便于比较，将2014年和2019年云斑白条天牛雌雄成虫的COI基因碱基序列长度统一为640 bp，经与Genebank 中的云斑白条天牛线粒体COI基因Blast比对，确认为云斑白条天牛COI基因。

2014年和2019年云斑白条天牛2个寄主种群的雌雄成虫的COI基因的碱基含量如表2所示，A+T的含量均高于65%，C+G的含量均低于35%，A+T含量明显偏高。危害白蜡树云斑白条天牛其雌成虫A+T含量表现为2019年比2014年略低，雄成虫的则是2019年比2014年略低；危害杨树的云斑白条天牛雌成虫A+T含量2019年比2014年略高，雄成虫2019年和2014年含量一样没有变化。由此可知，云斑白条天牛由2014年至2019年，经5年的短期进化，成虫COI基因的碱基含量有变化，但变化较小，且规律不明显。危害白蜡树的云斑白条天牛其雌雄成虫的A+T含量由2014年至2019年均略有下降，危害杨树的云斑白条天牛雌成虫A+T含量由2014年至2019年略有上升，雄成虫的没有变化。

表2 不同年度世代云斑白条天牛成虫CO I基因的碱基含量比较Tab.2 Base content comparison of CO I genes of different year generation adults of B.lineolata

2.2 CO I基因序列比较

危害白蜡树和杨树的云斑白条天牛种群的雌、雄成虫的COI基因序列在2014年和2019年世代个体间存在差异。由表3可见，同一寄主种群的雌雄个体间存在差异，危害白蜡树云斑白条天牛种群雌成虫COI基因在2019年和2014年世代个体间的序列相似度为99.50%，雄成虫为99.20%，雄成虫变化差异大于雌成虫；危害杨树云斑白条天牛种群雌成虫COI基因在2019年和2014年世代个体间的序列相似度为99.50%，雄成虫为98.9%，雄成虫变化差异大于雌成虫。可以推断，雄成虫的COI基因突变速度快于雌成虫，危害杨树云斑白条天牛雄成虫变化最大，突变最快。

表3 2019年和2014年云斑白条天牛成虫CO I基因碱基序列比对Tab.3 Base sequences alignment of CO I genes of 2019 and 2014 year adults of B.lineolata

不同寄主种群之间COI基因序列存在差异，危害杨树种群2019年和2014年世代个体间COI基因变化差异大于危害白蜡树种群，危害白蜡树云斑白条天牛雌、雄成虫COI基因在2019年和2014年世代个体间的平均相似度为99.35%，危害杨树云斑白条天牛种群的平均相似度为99.20%。据此也可推断，危害杨树云斑白条天牛的COI基因突变快于危害白蜡树云斑白条天牛种群。

2019年和2014年危害白蜡树云斑白条天牛雌成虫COI基因序列比对结果如图1所示，有3处不一致碱基，均为碱基转换，分别为47位点的A-G、362位点的T-C、605位点的C-T。

图1 2019年和2014年危害白蜡树云斑白条天牛雌成虫CO I基因序列比较Fig.1 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year female adults of B.lineolata attacking ash trees

2019年和2014年危害白蜡树云斑白条天牛雄成虫COI基因序列比对结果如图2所示，有5处不一致碱基，发生碱基转换4处，分别为位于第6位点的T-C、230位点的A-G、482位点的T-C和527位点的G-A；碱基颠换1处，为410位点的T-A。

图2 2019年和2014年危害白蜡树云斑白条天牛雄成虫CO I基因序列比较Fig.2 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year male adults of B.lineolata attacking ash trees

2019年和2014年危害杨树云斑白条天牛雌成虫COI基因序列比对结果如图3所示，有1处碱基缺失，缺失碱基位于2019年雌成虫的第12位点；1处碱基不一致，位于50位点的C-T，为转换碱基。

图3 2019年和2014年危害杨树云斑白条天牛雌成虫CO I基因序列比较Fig.3 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year female adults of B.lineolata attacking poplars

2019年和2014年危害杨树云斑白条天牛雄成虫COI基因序列比对结果如图4所示，有3处碱基缺失，缺失碱基位于2019年雄成虫的第369、382、514位点；1处碱基不一致，位于2014年雄成虫395位点(2019年雄成虫396位点)的G-C，为转换碱基。

图4 2019年和2014年危害杨树云斑白条天牛雄成虫CO I基因序列比较Fig.4 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year male adults of B.lineolata attacking poplars

2.3 CO I基因开放阅读框(ORF)比较

2.3.1 危害白蜡树云斑白条天牛种群COI基因的ORF

2014年和2019年危害白蜡树云斑白条天牛雌、雄成虫COI基因的ORF均为102 bp，可翻译为33个氨基酸。

4个COI基因的ORF序列

ATGTTTATAACAGTTGTAATAAAGTTAGCTGCGCCTAGAATAGAGGAAATTCCAGCTAGGTGTAAACTAAAAATAGCTAAATCAACAGAAGAACCTCTGTGA

OFR碱基翻译的氨基酸序列

MFITVVIKLAAPRIEEIPARCKLKIAKSTEEPL

由此可知，从2014年到2019年，危害白蜡树云斑白条天牛雌、雄成虫COI基因的ORF没有变化，翻译的氨基酸也没有变化。

2.3.2 危杨树云斑白条天牛种群COI基因的ORF

2014年和2019年危害杨树云斑白条天牛雌、雄成虫COI基因的ORF均为108 bp，可翻译为35个氨基酸。

4个COI基因的ORF序列

ATGATGGGGGTAATAATCAAAATCTTATATTATTTATTCGTGGAAAGGCTATATCGGGGGCTCCTAGTATTAGGGGTACTAGTCAATTTCCAAATCCACCAATTATAA

ORF碱基翻译的氨基酸序列

MMGVIIKILYYLFVERLYRGLLVLGVLVNFQIHQL

由此可知，从2014年到2019年，危害杨树的云斑白条天牛雌雄成虫的COI的ORF没有变化，翻译的氨基酸也没有变化。

综合以上比较，可知云斑白条天牛在2019年和2014年世代个体之间的COI基因变化差异：同一种群内部，危害白蜡树和杨树种群的雌、雄成虫的COI基因序列存在变化，但ORF没有变化；不同种群之间，不仅COI基因序列存在变化，ORF也有差异。

3 讨论与结论

通过对2014年和2019年不同寄主云斑白条天牛雌、雄成虫线粒体COI基因的比对分析可知，云斑白条天牛从2014年到2019年，历经5 a后，线粒体COI基因发生了碱基突变，序列相似度存在一定差异。无论是危害白蜡树的云斑白条天牛种群，还是危害杨树的云斑白条天牛种群，均表现为雄成虫变化差异大于雌成虫：危害白蜡树的云斑白条天牛雌成虫2019年和2014年COI基因的序列相似度99.5%，雄成虫为99.2%；危害杨树云斑白条天牛种群雌成虫2019年和2014年COI基因的序列相似度为99.5%，雄成虫为98.9%。2个寄主种群比较时，危害杨树种群的变化差异大于危害白蜡树种群，危害白蜡树云斑白条天牛雌雄成虫2019年和2014年COI基因的平均相似度为99.35%，危害杨树云斑白条天牛种群的平均相似度为99.20%。通过以上分析可得出，从2014年到2019年云斑白条天牛雌、雄成虫线粒体基因COI基因发生了一些碱基突变，线粒体基因碱基序列的变化，理论上也是对遗传适应的结果。

昆虫生命周期相对较短，在研究种群进化和遗传突变方面具有很多优势。5 a对多数昆虫而言，可以发生多个世代的更替，在世代更替的过程中，随着对环境的适应其遗传基因也将发生变化。云斑白条天牛通常2 a完成1个世代，生活时间跨越3个年度[11-13]，世代重叠严重，每年均可采集到成虫。从2014年采集的云斑白条天牛成虫和2019年采集到成虫之间至少发生4个世代，4个世代在生活习性和遗传结构上均会发生适应变化。

由于线粒体基因较为保守，不同年度世代个体间COI线粒体基因的少量碱基发生突变，但作为表达功能蛋白的关键碱基序列ORF并没有发生变化，表明其功能还没变化，这一点与线粒体基因的保守性相一致。可能伴随着进化时间的延长，ORF也会发生改变。

目前，有关昆虫线粒体基因雌雄个体差异的系统研究很少，仅能从少量文献中找到雌雄个体线粒体基因存在差异的数据资料[8-9,14]，未见其他学者对昆虫雌雄个体和不同年度世代个体线粒体基因差异的详细研究，以及线粒体基因分化原因的详细报道。本项研究发现了云斑白条天牛不同寄主种群间、同一寄主种群的雌雄个体间和不同世代个体间线粒体基因存在差异，差异分化的原因有待进一步深入研究确定。根据目前的研究数据推测，雄成虫COI基因变化大于雌成虫的主要原因为COI基因具有显著的母性遗传特性，雌性亲本(母亲)的基因直接遗传给雌性后代，而雄性个体后代则为雌雄交配，更容易发生突变，故而雌性个体变化小于雄性。杨树寄主种群COI基因变化大于危害白蜡树种群的主要原因为昆虫的发育速度与温度相关，危害杨树云斑白条天牛种群生活于南方的洞庭湖地区，危害白蜡树种群生活于黄河三角洲地区，洞庭湖地区的平均气温显著高于黄河三角洲地区，危害杨树种群云斑白条天牛的发育速度快于危害白蜡树种群。因此，其进化突变速度也快于危害白蜡树种群，线粒体基因的变化差异也大。

虽然未查询到其他昆虫不同年度世代个体间COI基因差异变化的相关研究，但在对云斑白条天牛的系统研究中不但发现线粒体COI基因碱基差异变化，还发现了生物学习性，尤其是成虫产卵习性的一些明显变化。在实际调查中发现，2019年危害白蜡树云斑白条天牛成虫较2014年的成虫，其产卵刻槽明显变浅，产卵量增加，空槽率下降，这可能是云斑白条天牛通过增加产量、降低咬产卵刻槽这一产卵行为的能量投入，而选择保持后代成活率相对稳定的繁殖策略，这也是生物进化适应的一个表现。