醋酸泼尼松对糖尿病肾病模型大鼠肾功能、肾脏炎性反应及AMPK/SIRT1信号通路的影响

邓九红，郑 超，王声遥，王心怡

(1.温州医科大学第二临床医学院， 浙江 温州 325035； 2.平阳县第二人民医院 内分泌科，浙江 平阳 325405)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重微血管病变之一，约占糖尿病患者的40%，也是导致终末期肾脏疾病的主要原因[1-2]。DN的病因复杂，肾脏炎性反应在促进DN的发展进程中至关重要[3]。目前，临床仍缺乏有效的药物来预防和治疗DN。醋酸泼尼松是肾上腺皮质激素类药，具有显著的抗炎作用，主要用于过敏性与自身免疫性炎性疾病[4]。近年来，醋酸泼尼松片治疗狼疮性肾炎[5]、肾病综合征[6]、特发性膜性肾病[7]疗效确切，可有效减轻病情程度，说明醋酸泼尼松片可减轻肾脏炎性反应，但其对DN是否具有药理活性却鲜有报道。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)信号通路是重要的能量传感信号传导途径，在糖尿病中具有调控作用[3]；AMPK失活和SIRT1水平降低与DN的进展有关，激活AMPK和SIRT1对降低氧化应激和炎性反应，保护DN小鼠肾损伤，降低蛋白尿有重要作用[8]。因此，本研究拟采用DN大鼠模型，探究醋酸泼尼松对DN大鼠肾脏炎性反应的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级SD雄性大鼠70只，6～8周龄，体质量(200±20)g[温州医科大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK(浙)2019-0009]。大鼠适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2 主要药品、试剂：醋酸泼尼松片(天津药业集团新郑股份有限公司，规格：5 mg)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司)；AMPK抑制剂compound C(CC，TargetMo公司)；空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、尿微量白蛋白(urine microalbumin，U-mAlb)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司)；苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色试剂、高碘酸-希夫(periodate schiff，PAS)染色试剂、放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(碧云天生物科技公司)；兔源AMPK、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)、SIRT1、乙酰化核因子-κB p65(acetylated nuclear factor-κB p65，ac-NF-κB p65)、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、β-肌动蛋白(β-actin)一抗和山羊抗兔二抗(英国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠分为对照组，喂以普通饲料。其余大鼠给予高糖高脂饲料喂养4周联合1次性腹腔注射STZ(55 mg/kg)成功制备DN模型[9]。模型判断标准：连续3 d大鼠FBG>16.7 mmol/L，且出现典型的“三多一少”(即多食多饮多尿，体质量减少)表现，连续3次U-mAlb>15 μg/mL，且病理学检查发现肾组织出现明显病变(表现为肾小管管腔变大，肾小球体积变小，系膜细胞增生，基底膜增厚，大量炎性细胞浸润)。成功造模48只大鼠，将造模成功的大鼠随机分为模型组、醋酸泼尼松低(6.25 mg/kg)、高(12.5 mg/kg)剂量组、醋酸泼尼松+CC组(醋酸泼尼松12.5 mg/kg+compound C 0.2 mg/kg)[10]，每组12只。分组完成后于给药前收集大鼠24 h尿液检测了U-mAlb水平，并通过尾末梢采血检测了FBG水平以及经过眼眶静脉丛取血检测了血清SCr、BUN水平，结果显示模型大鼠U-mAlb、FBG、SCr、BUN水平均较对照组显著升高(P<0.05)，说明分组均匀。

分组完成后，醋酸泼尼松各剂量组分别给予相应剂量的醋酸泼尼松灌胃，醋酸泼尼松+CC组大鼠在给予醋酸泼尼松灌胃的同时腹腔注射0.2 mg/kg的compound C，对照组和模型组灌胃等量的蒸馏水，1次/d，灌胃体积10 mL/kg，共给药4周。醋酸泼尼松给药剂量根据其临床剂量(60 kg成人给药剂量60 mg/d)，按种属间体表面积换算，大鼠对应给药剂量为成人的6.25倍，换算大鼠等效剂量为6.25 mg/kg，因此，设置醋酸泼尼松低、高剂量为6.25、12.5 mg/kg。

1.2.2 大鼠一般状态观察及FBG、24 h U-mAlb的检测：实验过程中观察大鼠的毛色、饮食饮水量、尿量、体质量等一般状态；采集尾末梢全血，检测给药结束后大鼠FBG水平；并在给药结束后通过代谢笼收集大鼠24 h尿液，检测大鼠尿液24 h U-mAlb含量。

1.2.3 大鼠血清SCr、BUN和炎性因子水平的检测：实验结束时，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清，检测大鼠血清SCr、BUN、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.2.4 肾脏组织病理形态学变化的检测：取大鼠右侧肾组织，于4%多聚甲醛中固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行HE和PAS染色，观察肾脏病理学变化。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测肾组织AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白的表达：取大鼠部分肾组织，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中匀浆，以20 000 r/min的速度在4 ℃离心10 min。取上清，BCA法进行蛋白定量，RIPA平衡蛋白浓度后加热变性，然后取等量蛋白样品上样(30 μg)，凝胶电泳分离，湿转法转膜，5%脱脂奶封闭膜1 h，随后在4 ℃下与一抗(AMPK、p-AMPK、SIRT1、ac-NF-κB p65、NF-κB p65、MCP-1、β-actin，按1∶1 000的比例稀释；β-actin按1∶2 000的比例稀释)孵育过夜，第2天加入二抗室温下孵育2 h，洗去二抗，ECL显色，以β-actin为内参，分析膜上蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般状态

对照组大鼠精神良好，活跃度高，毛色有光泽，饮食正常，垫料干燥；模型组大鼠出现不同程度的精神萎靡，活动减少，毛色发黄无光泽，进食和饮水量明显增多，尿量也增多，垫料潮湿，大便糖稀状；给药结束后，醋酸泼尼松低、高剂量组大鼠上述症状较模型组大鼠明显好转，而醋酸泼尼松+CC组大鼠一般状态较醋酸泼尼松高剂量组有加重趋势。

2.2 各组大鼠FBG和肾功能指标的变化

与对照组相比，模型组大鼠FBG、24 h U-mAlb、血清SCr、BUN水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，醋酸泼尼松低、高剂量组大鼠FBG、24 h U-mAlb、血清SCr、BUN水平显著降低(P<0.05)；与醋酸泼尼松高剂量组相比，醋酸泼尼松+CC组大鼠上述指标显著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠FBG和肾功能指标的比较Table 1 Comparison of FBG and renal function indexes of rats in each group n=12)

2.3 各组大鼠血清炎性因子水平

与对照组相比，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，醋酸泼尼松低、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05)；与醋酸泼尼松高剂量组相比，醋酸泼尼松+CC组大鼠上述指标显著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠血清炎性因子水平比较Table 2 Comparison of serum inflammatory factor levels of rats in each pg/mL, n=12)

2.4 各组大鼠肾组织病理学变化

对照组大鼠肾组织染色均匀，结构清晰，肾小球、肾小管形态正常，肾小管上皮细胞排列整齐，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠肾小管-肾间质出现局灶性病变，肾小管管腔变大，空泡化明显，胞质染色变浅，肾小球体积变小，肾小管上皮细胞核固缩，大量炎性细胞浸润，肾小球系膜细胞增生，系膜区扩大，基底膜增厚；醋酸泼尼松低、高剂量组大鼠上述肾脏病变情况明显改善，炎性细胞浸润、系膜细胞和基质增生减轻，肾小管扩张数量减少，且醋酸泼尼松高剂量组改善效果较优；而醋酸泼尼松+CC组大鼠肾脏病变较醋酸泼尼松高剂量组有加重趋势(图1)。

A.control group; B.model group; C.prednisone acetate low dose group; D.prednisone acetate high dose group; E.prednisone acetate+CC group图1 各组大鼠肾组织病理学变化Fig 1 Renal histopathological changes of rats in each group (HE and PAS staining)

2.5 各组大鼠肾组织AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白表达

与对照组相比，模型组大鼠肾组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表达显著降低，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，醋酸泼尼松低、高剂量组大鼠肾组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表达显著升高，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表达显著降低(P<0.05)；与醋酸泼尼松高剂量组相比，醋酸泼尼松+CC组大鼠肾组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表达显著降低，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表达显著升高(P<0.05)(图2，表3)。

1.control group; 2.model group; 3.prednisone acetate low dose group; 4.prednisone acetate high dose group; 5.prednisone acetate+CC group图2 各组大鼠肾组织AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白的表达Fig 2 Expression of AMPK/SIRT1 pathway related proteins in renal tissue of rats in each group

表3 各组大鼠肾组织AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白表达比较Table 3 Comparison of AMPK/SIRT1 signal pathway related protein expression in renal tissue of rats in each group n=12)

3 讨论

糖尿病产生的高血糖状态会刺激趋化因子的产生，随后介导白细胞进入肾组织产生炎性反应，促进DN的发生发展，因此靶向炎性反应是防治DN发展的有效途径[11]。

高血糖可以触发NF-κB，NF-κB p65活化进入细胞核后可激活转录，诱导下游多种细胞因子的转录，如MCP-1、TNF-α和白介素系统(IL-6、IL-1β)[12]。醋酸泼尼松是强效的免疫抑制剂和抗炎药，被广泛用于过敏性与自身免疫性炎性疾病的治疗[4]；其对肾炎具有显著的改善作用，可有效改善肾病综合征患者肾功能、血脂水平，并降低尿蛋白含量[5-7]。在本次研究中，采用高糖高脂饲料联合STZ腹腔注射成功建立DN大鼠模型，肾功能损伤严重；而醋酸泼尼松干预后可明显减轻DN大鼠的肾功能损伤，使大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1蛋白水平降低。

AMPK是一种对能量高度敏感的丝氨酸/苏氨酸激酶，与糖尿病密切相关[13]。SIRT1是AMPK的下游效应分子，是一种依赖NAD+的脱乙酰酶，它通过使目标分子脱乙酰化而激发转录因子的抑制活性，抑制与炎性有关的基因的转录，参与炎性反应的调节。研究表明，NF-κB p65亚单位上310位赖氨酸(Lys)的乙酰化修饰水平与NF-κB的活性有明显的正相关性[14]。AMPK磷酸化后可激活SIRT1，而SIRT1可将p65蛋白的Lys310位点去乙酰化，减弱NF-κB p65的转录激活能力[15]。本研究结果显示，DN大鼠肾组织中AMPK/SIRT1通路失活。经醋酸泼尼松干预后，肾组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表达升高，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表达降低；说明AMPK/SIRT1通路被激活；而AMPK抑制剂compound C可明显减弱醋酸泼尼松对AMPK/SIRT1通路的激活作用；提示，醋酸泼尼松可能通过激活AMPK/SIRT1通路，抑制NF-κB活化。

综上所述，醋酸泼尼松可减轻DN大鼠肾脏炎性反应，保护肾功能，其作用机制可能与激活AMPK/SIRT1通路，进而抑制NF-κB的激活有关。本研究仅从炎性反应的角度探究了醋酸泼尼松对DN的保护机制，然而，在DN中，除炎性反应外，其他机制(如氧化应激和自噬)与肾功能损伤密切相关，醋酸泼尼松能否通过影响氧化应激或自噬保护肾功能，有待进一步研究。