IgA肾病患者外周血microRNA-223、NLRP3水平与肾间质纤维化的相关性*

朱付英，李瑾，阎其均，周晓莉

（1.重庆市綦江区人民医院 检验科，重庆401420；2.重庆医科大学附属第一医院心血管内科，重庆400016）

IgA 肾病（IgA nephropathy, IgAN）是临床原发性肾小球肾炎最常见的类型之一，一般表现为肾小球系膜区IgA 沉积，并常伴有其他免疫球蛋白沉积，20%～40%患者在发病10年后发展为慢性肾衰竭， 进入终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）[1-2]。肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）是IgAN 等大部分慢性肾脏病发展到ESRD 的病理学基础及共同途径之一，病理特征为肾小管萎缩、细胞外基质增多、细胞凋亡等，因而RIF 程度是影响IgAN 进展及预后的重要因素[3-4]。NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3, NLRP3）炎性体由凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein, ASC）、NLRP3 和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶前体组成。近几年有研究发现，其在肾脏炎症进程中发挥重要调节作用[5]。MicroRNA（miRNA）是由18～23 个核苷酸组成的非编码RNA，可与靶基因3´-UTR 区配对结合，抑制或降低靶基因表达，从而参与机体的生理调控[6-7]。有研究发现，miR-223 可靶向下调NLRP3 水平以缓解炎症反应[8]。IgAN 患者外周血microRNA-223（miR-223）、NLRP3 与RIF 的相关性未见报道，因此本研究通过测定IgAN 患者、健康者及非IgAN 者的外周血miR-223、NLRP3 mRNA 相对表达量及RIF 指标，来分析miR-223、NLRP3 mRNA 与RIF 的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2020年1月在重庆市綦江区人民医院经肾组织病理检查确诊为原发性IgAN 患者164 例作为研究对象。其中，男性90 例，女性74 例；年龄22～64 岁，平均（34.27±8.17）岁。根据肾小管萎缩或RIF 面积将患者分为3 组[9]：①肾小管萎缩或RIF 面积≤25%患者70 例作为RIF T0 组；②肾小管萎缩或RIF 面积> 25%～50%患者54 例作为RIF T1 组；③肾小管萎缩或RIF 面积> 50%患者40 例 作为RIF T2 组。

另取本院健康体检志愿者95 例作为对照A 组，其中男性52 例，女性43 例；年龄24～67 岁，平均（36.10±9.22）岁；体检显示肝肾功能、尿常规正常，无糖尿病及心脑血管、高血压病史。

另取同期本院非IgAN 患者80 例作为对照B 组，其中男性38 例，女性42 例；年龄23～65 岁，平均（35.26±8.07）岁；其中局灶阶段增生/硬化14 例、膜性肾病37 例、轻度系膜增生13 例、微小病变性肾病16 例；排除近期使用过糖皮质激素、甾体类消炎药，以及合并病毒性肝炎、恶性肿瘤及甲状腺疾病者。

本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，经医院医学伦理委员会审核批准，患者及家属签订知情同意书。

1.2 纳入标准

①病例资料完整，年龄>18 岁；②肾活检前未使用免疫抑制剂、糖皮质激素、调脂药等；③肾活检电镜、免疫荧光、光镜资料完整，且活检肾小球数目> 10 个；④排除紫癜性肾炎、乙肝病毒、高血压肾损害、甲状腺病及狼疮肾炎等继发性IgAN；⑤患者近期无慢性炎症反应。

1.3 主要试剂和仪器

miR-233、NLRP3 及内参U6、GAPDH 引物由美国金唯智公司合成，Trizol 试剂、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）试剂盒由武汉纯度生物科技有限公司提供，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein, MCP-1）、转化生长因子α（transforming growth factor-α,TGF-α）、白细胞介素6（Interleukin-6, IL-6）、缺氧诱导因子α（hypoxia inducible factor-α, HIF-α）等酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒均由南京森贝伽生物科技有限公司提供。

WD-320 型全自动生化分析仪由武汉医盾医疗器械有限公司提供，ProFlex™PCR 系统由美国赛飞世尔科技公司提供。

1.4 观察指标

收集各组年龄、性别、既往史、发病情况、用药史、舒张压（diastolic blood pressure, DBP）、收缩压（systolic blood pressure, SBP）、平均动脉压（mean arterial pressure,MAP）。

测定各组血总蛋白（total protein, TP）、血红蛋白（Hemoglobin, Hb）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、白蛋白（Albumin, Alb）、尿酸（uric acid, UA）、胱抑素C（cystatin C, CysC）、24 h 尿蛋白。肾小球滤过率（glomerular filtration rate, GFR）结果采用CKDEPI 公式[10]。

1.5 qRT-PCR测定各组外周血miR-223、NLRP3 mRNA

收集各组空腹静脉外周血10 mL，在4℃条件下放置0.5 h，3 000 r/min 离心10 min，取血清置于-80℃冰箱冷冻保存。采用Trizol 试剂提取血清总RNA，逆转录获到cDNA。逆转录体系：0.4 μL M-MLV，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，0.3 μL RNA 酶抑制剂，2 μL 10×缓冲液，补加超纯水至20 μL。qRT-PCR 反应体系：正反向引物各1 μL，PCR 缓冲液12.5 μL，150 ng cDNA 1.0 μL，Tag 酶0.5 μL。扩增条件：94℃预变性10 min，94℃变性30 s、，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 个循环，72℃继续延伸10 min。采用2-∆∆CT法对miR-223、NLRP3 mRNA 进行定量分析。qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 ELISA测定各组外周血RIF指标

采用ELISA 测定各组外周血RIF 指标，包括TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α，各指标检测均按相应试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q法；相关性分析用Pearson 法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床资料比较

对照A 组、对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组的性别、年龄比较，经χ2检验或单因素方差分析，差异无统计学意义（P>0.05）。各组MAP、Hb、TP、Alb、UA、24 h 尿蛋白、CysC、GFR 水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较结果显示：与对照A 组比较，对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组患者Hb、TP、Alb、GFR 水平依次降低（P<0.05），而MAP、UA、CysC 水平依次升高（P<0.05），RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组24 h 尿蛋白依次升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组临床资料比较 例（%）

2.2 各组外周血miR-223、NLRP3 mRNA 相对表达量比较

对照A 组、对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组miR-223、NLRP3 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较结果显示：与对照A 组比较，对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组患者miR-223 相 对表达量依次降低（P<0.05），NLRP3 mRNA 相对表达量依次升高（P<0.05）。见表3。

表3 各组外周血miR-223、NLRP3 mRNA相对表达量比较 （±s）

表3 各组外周血miR-223、NLRP3 mRNA相对表达量比较 （±s）

注：①与对照A 组比较，P<0.05；②与对照B 组比较，P<0.05；③与RIF T0组比较，P<0.05；④与RIF T1组比较，P<0.05。

NLRP3 mRNA 1.17±0.16 1.26±0.18①1.45±0.19①②1.68±0.21①②③1.83±0.22①②③④131.345 0.000组别对照A组对照B组RIF T0组RIF T1组RIF T2组F 值P 值n 95 80 70 54 40 miR-223 1.07±0.12 0.92±0.11①0.83±0.09①②0.70±0.08①②③0.61±0.07①②③④205.770 0.000

2.3 各组外周血TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α水平比较

对照A 组、对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较结果显示：与对照A 组比较，对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组患者TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平依次升高（P<0.05）。见表4。

表4 各组外周血TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α水平比较 （±s）

表4 各组外周血TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α水平比较 （±s）

注：①与对照A组比较，P<0.05；②与对照B组比较，P<0.05；③与RIF T0组比较，P<0.05；④与RIF T1组比较，P<0.05。

组别对照A组对照B组RIF T0组RIF T1组RIF T2组F 值P 值n 95 80 70 54 40 HIF-α/（μg/L）10.62±9.31 23.47±5.73①46.24±11.47①②71.98±18.26①②③142.67±36.56①②③④530.832 0.000 TGF-β1/（ng/L）176.84±40.23 287.38±51.61①417.70±120.26①②590.87±125.46①②③794.76±242.85①②③④259.040 0.000 MCP-1/（ng/L）25.58±10.16 36.38±11.98①43.76±13.94①②52.76±15.49①②③63.08±17.13①②③④73.732 0.000 TGF-α/（ng/L）18.84±5.16 25.58±8.62①32.66±15.04①②57.21±17.05①②③102.48±25.84①②③④299.784 0.000 IL-6/（ng/L）14.06±4.25 20.18±4.62①63.71±17.12①②94.58±16.37①②③125.42±20.16①②③④841.591 0.000

2.4 IgAN患者外周血miR-223、NLRP3 mRNA与RIF指标的相关性

Spearman 相关性分析结果显示，IgAN 患者TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 与miR-223呈负相关（P<0.05），而与NLRP3 mRNA 呈正相关（P<0.05）。见表5。

表5 IgAN患者外周血miR-223、NLRP3与RIF指标的相关性

3 讨论

RIF 患者肾细胞外基质代谢失衡，导致大量炎症因子和细胞外基质沉积在肾间质，从而破坏肾脏，诱导大量纤维细胞聚集，表现为肾小球和肾血管周围血管硬化、变薄等症状[11-12]。RIF 与IgAN患者肾脏功能、预后与Oxford 分型相关，是导致IgAN 等肾脏疾病预后不良的主要原因[13]。CysC、UA 是反映肾功能的临床指标，是经肾脏排出的蛋白和嘌呤的代谢物，是临床上反映肾损伤的常规生化因子。CysC 是低分子蛋白，可自由通过肾小球，然后经肾曲小管重吸收后分解代谢；肾脏是代谢清除CysC 的唯一器官，肾功能异常可导致血清CysC 水平上调，因此测定血清CysC 水平可以检测肾功能[14]。本研究纳入IgAN 患者、非IgAN 患者和健康志愿者进行研究，结果表明各组受试者的年龄、性别无差异，而外周血Hb、TP、Alb、GFR水平在IgAN 患者中随RIF 程度加重而依次降低，UA、CysC 及24 h 尿蛋白随之依次升高，说明IgAN患者肾功能受损与RIF 程度相关。

NLRP3 炎性体可被内源性损伤相关分子模式及外源性病原相关分子模式激活，但其激活的具体机制尚未明确[15]。NLRP3 炎性体能够与凋亡相关蛋白Caspase-1 等形成复合物，以活化Caspase-1，从而发挥调控作用。有研究还发现，在糖尿病肾病小鼠模型中，肾小球细胞可激活NLRP3，诱导糖尿病及肾小球损伤[16]。此外，高尿酸血可活化NLRP3，上调近端小管炎症介质水平，加重糖尿病肾病病情[17]。miR-223 作为一种非编码小分子RNA，在血小板、内皮细胞及血浆中广泛存在。近年来有研究发现，其参与多种疾病的病理生理进程，如肝癌、系统性红斑狼疮等疾病[18-19]。有研究表明，miR-223 可抑制NLRP3 表达，从而下调IL-1β、IL-18 水平，以减轻小鼠急性放射性肺组织炎症反应[20]。miR-223 还可与NLRP3 的3´UTR 区配对结合，以调控IL-1β 等炎症介质表达，从而调控肠道炎症[21]。全基因扫描结果也进一步证实NLRP3 属于miR-223 作用靶点之一[19]。

本研究结果表明，与对照A 组比较，对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组患者miR-223 相对表达量依次降低，NLRP3 mRNA 相对表达量依次升高，说明miR-223 可能通过调控NLRP3 表达进而影响IgAN 患者RIF 的发生、发展。TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 等指标是临床常用来评价RIF进程的生物因子。有研究发现，IgAN 患者血清丙二醛与上述因子呈正相关，而与谷胱甘肽过氧化物酶、氧化物歧化酶、过氧化氢酶呈负相关，提示血清氧化应激指标与RIF 程度相关，其可能参与RIF 的发生、发展过程[22]。本研究结果表明，与对照A 组比较，对照B 组、RIF T0 组、RIF T1 组、RIF T2 组 患者TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平依次升高，同样说明IgAN 患者RIF 会导致TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平升高。Spearman相关性分析结果显示，IgAN患者miR-223与TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 呈负相关，NLRP3 mRNA 与TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α呈正相关，说明miR-223、NLRP3与RIF指标具一定相关性，推测两者可能共同参与RIF 的发生、发展进程。

综上所述，IgAN 患者外周血miR-223 低表达，NLRP3 mRNA 高表达，两者均与RIF 有相关性，可能参与RIF 的发生、发展进程。但本研究仍存在不足之处，纳入研究对象较少，结果可能存在偏倚，且对非IgAN 患者RIF 情况未明确分析，后期实验将在大样本基础上剔除混杂因素，深入研究miR-223、NLRP3 在IgAN 中的具体作用机制。