miR-195 调控人乳腺癌细胞MCF-7 增殖与凋亡的作用及机制研究

刘嘉祺 翟凤国 高金霞 刘佳维 杨旭东 周福波 李孟全

1.牡丹江医学院药理教研室，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江医学院预防医学教研室，黑龙江牡丹江 157011；3.牡丹江医学院有机化学教研室，黑龙江牡丹江 157011；4.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江牡丹江 157011

乳腺癌是导致患者死亡的常见妇科恶性肿瘤[1-2]，其发病机制尚不十分清楚。蛋白磷酸酶1D（protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta，PPM1D）为一种癌基因，在乳腺癌细胞中高表达，发挥重要作用[3-5]。miR-195 为非编码RNA 分子[6-7]，调控癌症发生发展过程[8-10]。而miR-195 在乳腺癌发病机制中扮演着什么样的角色？miR-195 与靶基因的调控作用怎样?目前相关报道尚少。本实验观察人乳腺癌细胞miR-195 和PPM1D 表达，探讨miR-195 对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制，旨在为乳腺癌的发生机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM 高糖培养基（货号：11995）；胎牛血清（货号：SV30087）；胰蛋白酶消化液（货号：C0201）；蛋白酶抑制剂（货号：P1005）；细胞裂解液（货号：P0013）；中国上海碧云天生物公司；SYBR qPCR Mix，RtqPCR Kit（货号：FSQ-101）；日本东洋纺（上海）生物科技有限公司；X-treme GENE siRNA（货号：04476093 001），瑞士罗氏公司；DAPI 染色液（货号：E-IR-R103），中国武汉博士德生物工程有限公司；TUNEL 试剂盒（货号：11684817910），瑞士罗氏公司。

1.2 细胞培养

正常乳腺上皮细胞MCF-10A 和人乳腺癌细胞MCF-7 复苏，细胞沉淀中加入细胞培养液，转移至培养瓶，37℃，5% CO2孵箱培养。待细胞生长至70%～80%，适量胰蛋白酶消化细胞，补足培养液，继续培养。

1.3 MCF-7 转染

MCF-7 瞬时转染，实验MCF-7 组；miR-195 mimics组（MCF-7 转染miR-195 拟似物）；miR-195 inhabitor组（MCF-7 转染miR-195 抑制剂）；阴性对照NC 组（MCF-7 转染无关阴性对照序列negative control，NC）。转染过程避光进行，36 h 后进行后续实验。

1.4 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞增殖

将各实验组细胞接种于96 孔板中，各实验组设5 个复孔。MTT 溶液（20 μl/孔）培养箱中孵育4 h。随后加150 μl 二甲基亚砜，室温摇床振荡10 min。490 nm 波长下检测各孔吸光度值。

1.5 DNA 断裂的原位末端标记法（TdT-mediatedduTP nick end labeling，TUNEL）法检测细胞凋亡

培养细胞，将灭菌后的玻片铺于24 孔板中，每孔加入500 μl 细胞悬液。孵育48 h 后处理细胞，参照TUNEL 检测试剂盒检测细胞凋亡。

1.6 蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）检测蛋白表达

转染的细胞用刮刀刮下，2500 r/min，4℃离心10 min。弃上清，每份样品加入RIPA 和蛋白酶抑制剂，冰上超声破碎。经10%丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭，室温摇床2～3 h，孵育一抗PPM1D 和β-actin，4℃孵育过夜。洗膜，室温孵育荧光二抗，再洗膜。总蛋白以β-actin 作内参，红外荧光扫描系统检测，odyssey 软件进行光密度积分值分析。

1.7 qRT-PCR 法检测miR-195 表达

qRT-PCR 包括总RNA 提取，逆转录和实时荧光定量PCR 三部分。逆转录反应体系：5×RT buffer 2 μl，RT Enzyme mix 0.5 μl，Primer mix 0.5 μl，Random 引物1 μl，总RNA 0.5 μg，Nuclease-Free Water 将反应体系补至10 μl。PCR反应体系：SYBR 混合体系10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，cDNA 1 μl，Nuclease-Free Water 7 μl 补足至20 μl。PCR 扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，U6 为内参，ABI Prism®7500 fast 仪器设置40 个循环。miR-195-5p 正向引物5’-GCGCGTAGCAGCACAGAAA-3’，反向引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；U6 正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.8 荧光素酶报告基因验证靶向调控作用

将HEK293 细胞接种于96 孔板，24 h 后转染miR-195 mimics 或阴性对照NC 及含miR-195 结合PPM1D 3’UTR 序列或突变序列的质粒，48 h 后通过双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

应用GraphPad Prism 6.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞系miR-195 表达

qRT-PCR 结果，MCF-7 组miR-195 表达低于MCF-10A 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

2.2 不同细胞系PPM1D 表达

WB 结果，MCF-7 组PPM1D 蛋白表达高于MCF-10A 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

2.3 miR-195 对人乳腺癌MCF-7 细胞增殖和凋亡影响

MTT 结果，miR-195 mimics 组细胞活力明显低于MCF-7 组，miR-195 inhabitor 组细胞活力高于MCF-7 组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图3。TUNEL 结果，miR-195 mimics 组细胞凋亡率明显高于MCF-7 组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；miR-195 inhabitor 组细胞凋亡率低于MCF-7 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4～5。

图4 TUNEL 染色图像显示绿色为凋亡细胞，为DAPI 染色细胞核（40×）（n=3）

图5 TUNEL 结果（n=3）

2.4 miR-195 对PPM1D 调控作用

通过TargetScan 等miRNA 靶基因预测网站，预测miR-195 可能调控的靶基因。Has-miR-195-5p 的5’端有能够与PPM1D mRNA 3’非翻译区（untranslated area，UTR）互补区域，提示miR-195 可能在转录后水平靶向调控PPM1D 基因表达。见图6。

图6 预测miR-195 与PPM1D 3’UTR 之间结合位点

携带含有PPM1D 基因片段miR-195 mimics 组荧光素酶的活性低于MCF-7 组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；携带含有突变PPM1D 基因片段miR-195 mimics 组与MCF-7 组荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图7。

图7 miR-195 对PPM1D mRNA 3’UTR 调控作用（n=3）

3 讨论

微RNA 与多种癌症发病机制密切相关[11-13]，其中miR-195 在癌细胞中表达异常[14-19]，扮演着关键角色。PPM1D 为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，是一种重要的肿瘤蛋白[20-23]，对许多重要的肿瘤抑制途径具有负调控作用[24-25]。在本实验中，MCF-7 组miR-195 表达低于MCF-10A 组，而PPM1D 蛋白表达高于MCF-10A 组。MCF-7 转染miR-195 mimics 后，细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著增高；转染miR-195 inhabitor 后，细胞活力明显增高，细胞凋亡率降低。提示miR-195 对细胞的增殖和凋亡有一定程度影响。本文进一步探究miR-195 对人乳腺癌细胞增殖和凋亡作用机制。通过查询，PPM1D mRNA 的3’端有miR-195 可结合的序列。双荧光素酶报告基因实验显示，PPM1D 是miR-195 直接作用的靶点。

综上，MCF-7 中miR-195 与PPM1D 呈负相关，miR-195 可能通过直接靶向PPM1D mRNA 的3’-UTR，调控乳腺癌细胞的增殖与凋亡，这也是其调控机制的一部分，对于乳腺癌发病过程中所涉及miR-195正向作用或PPM1D 反向作用机制，还有待于进一步研究。