载姜黄素靶向脂质体对心肌梗死的治疗研究

扈丹丹 杨志浩 高亚丽 蒋 蕾 王 娜 刘肖莹

哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江大庆 163319

心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死[1]。天然产物作为一种有效、副作用小的药物逐渐被临床重视，白藜芦醇、姜黄素等在保护和治疗心血管疾病方面起到重要作用[2-3]。姜黄素是姜黄发挥药理作用重要的活性成分[4-7]，具有抗炎、保护肝脏及抗癌等作用[8-12]。此外，姜黄素具有心肌保护作用[13-15]，但姜黄素水溶性差，生物利用度低，限制了应用[16-17]。脂质体（liposome，LIP）和纳米乳剂等纳米制剂是促进姜黄素释放的优良载体制剂[18-20]。抗cTnI 抗体修饰的脂质体具有心肌靶向性[21-22]，本研究旨在探讨cT-Cur-LIP 将姜黄素聚集于靶区并发挥治疗心肌梗死的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

实验动物购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[许可证：SCXK（吉）2018-0007，合格证：201900031031]，动物室内饲养，已通过哈尔滨医科大学（大庆）伦理审查；大鼠心肌细胞H9c2 购于中科院上海细胞生物学研究所。H9c2 细胞用10%胎牛血清的DMEM 培养，37℃、5%CO2。

1.2 药物与试剂

姜黄素（纯度＞98%）458-37-7（北京伊诺凯科技有限公司，P1671481）；抗cTnI 抗体（1.0 mg/ml）（北京安诺伦生物科技有限公司，QTS20190103）；蛋黄卵磷脂[艾伟拓（上海）医药科技有限公司，AL18001]；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，DSPE-PEG2000[艾伟拓（上海）医药科技有限公司，B50845]。

1.3 仪器

粒度电位分析仪（英国Malvern instruments 公司，Zetasizer Nano S90）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter 有限公司，CytoFLEX S）；酶标仪（美国博腾仪器有限公司，SYNERGY/HTX）；DeltaVision 显微镜系统（美国GE 有限公司，DeltaVision Ultra）。

1.4 抗cTnI 抗体修姜黄素脂质体（anti-cTnI antibody modified curcumin liposome，cT-Cur-LIP）的制备

1.4.1 LIP 的制备 胆固醇、DSPE-PEG2000、蛋黄卵磷脂、三氯甲烷溶解。避光旋蒸，生理盐水水化。超声200 W，10 s，间隔5 s，20 次，220 nm 滤膜过滤，即得。

1.4.2 Cur-LIP 的制备 按照“1.4.1”的方法，成膜时加姜黄素。

1.4.3 抗cTnI 抗体修饰脂质体(anti-cTnIantibody-liposome，cT-LIP)的制备 DSPE-PEG2000-MAL 3.3 mg 溶于1 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]缓冲溶液中。50 μl 抗cTnI 抗体溶于1 ml HEPES 缓冲溶液中。将两者等体积混合，4°C 12 h，得DSPEPEG-MAL-cTnI。透析30 min。将DSPE-PEG2000-MAL-cTnI 与等体积的LIP 37°C 孵育2 h，得cT-LIP。

1.4.4 cT-Cur-LIP 的制备 按照“1.4.3”的方法，将DSPE-PEG2000-MAL-cTnI 与等体积的Cur-LIP 37°C孵育2 h，得cT-Cur-LIP。

1.4.5 cT-Cur-LIP 粒径和电位的测定 马尔文激光粒度分析仪测定电位，平均粒径，重复3 次。

1.4.6 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的包封率测定 姜黄素脂质体破膜后测得的浓度为C1，未处理测得的姜黄素脂质体浓度为C2，重复3 次。包封率（%）=（C1/C2）×100%。

1.4.7 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的释放率测定 紫外分光光度计检测24 h 透析外液的吸光度，代入以姜黄素浓度梯度为横坐标，吸光度作为纵坐标的标准曲线中，计算出该时间点释放率，重复3 次。

1.4.8 稳定性 将Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 分别取1 ml 至标品瓶中，同时在4℃避光条件下第0、1、7、15天拍照对比，观察其稳定性。

1.5 细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK8）检测法

将细胞接种贴壁后，缺氧培养3 h，分别加入浓度为13、20、27、40、54 μmol/L 的Cur、Cur-LIP 和cTCur-LIP。24 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8，2 h 后酶标仪测定450 nm 的吸光度，计算细胞存活率，重复3 次（体外实验在缺氧条件下，模拟体内心肌缺血生理环境，构建细胞模型）。

1.6 流式细胞术

细胞培养同上后，加入Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，避光2 h。流式细胞仪检测，重复3 次。

1.7 活细胞工作站

细胞培养同上，用Hoechst 33258（10 g/L）染核和Dio（6 g/L）染膜，5 min，加入Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，间隔15 s，30 min，电子显微镜成像。

1.8 TTC 染色

SPF 级Wistar 大鼠40 只，雌雄各半，6～8 周龄，体质量180～220 g，将40 只大鼠按照随机数字表分为假手术组、模型组、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，每组10只。采用结扎冠状动脉前降支法建立心肌梗死模型，若心电图可见Ⅱ导联ST 段呈弓背向上，较术前抬高0.2 mV 以上即可认为造模成功。尾静脉注射Cur-LIP和cT-Cur-LIP，每2 天1 次，持续2 周。心脏组织切片，2%TCC 染色20 min。观察变化。

1.9 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法

取离体心脏同上。4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋12 h，干燥3 h。脱蜡，染色，封片，24 h 后荧光成像。

1.10 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用方差分析。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cT-Cur-LIP 的表征

2.1.1 特征考察 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 包封率分别是（87.98±1.09）%和（89.94±1.67）%，24 h 释放率分别是（65.06±0.14）%和（62.68±5.73）%。各粒子粒径、电位见表1。

表1 各组粒径及电位（，n=3）

表1 各组粒径及电位（，n=3）

注 cT-Cur-LIP：抗cTnI 抗体修姜黄素脂质体

2.1.2 cT-Cur-LIP 的表征 cT-Cur-LIP 如图1 所示，表面形态规整，呈椭圆形。

图1 cT-Cur-LIP 的电镜图

2.1.3 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的稳定性考察 图2分别为Cur-LIP、cT-Cur-LIP 在4°C 避光条件下放置15 d，在第0、1、7、15 天观察溶液澄清无沉淀。

图2 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的稳定性

2.2 细胞存活率

药物浓度为27 μmol/L 时，cT-Cur-LIP 心肌细胞存活率高于Cur，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 对H9c2 细胞的毒性（n=3）

2.3 测定药物的摄取

cT-Cur-LIP 摄取量高于Cur 和Cur-LIP，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

图4 Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的摄取（n=3）

2.4 观察药物的摄取

图5 显示，cT-Cur-LIP 在心肌细胞中富集，而Cur-LIP 在心肌细胞中聚集较少。

图5 心肌细胞对Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 摄取

2.5 cT-Cur-LIP 治疗心肌梗死大鼠的效果

2.5.1 TTC 染色 假手术组心脏切片全部呈现深色；心肌梗死组基本为白色；Cur-LIP 组大部分呈白色，小部分为深色；cT-Cur-LIP 组大部分呈深色，小部分为白色。见图6。

图6 TTC 染色验证cT-Cur-LIP 对心肌梗死的疗效

2.5.2 HE 染色 假手术组心肌组织的形态和细胞核大小一致，纤维排列均匀，胞浆横纹清晰；模型组胞浆横纹消失，形成深浅不一的横带，核碎裂溶解；Cur-LIP 组胞浆横纹消失，细胞核固缩；cT-Cur-LIP 组心肌细胞的纤维排列均匀，胞浆横纹清晰，但局部横纹消失。见图7。

图7 HE 染色验证cT-Cur-LIP 对心肌梗死的疗效

3 讨论

本研究结合抗体介导的药物传递系统原理，设计了一种心肌靶向的纳米靶向制剂[23]。cTnI 作为心肌梗死的黄金标准标志物，仅在心脏损伤时才会特异性表达[24-25]，将抗cTnI 抗体偶联的磷脂衍生物嵌入到姜黄素脂质体，即得到cT-Cur-LIP。体内结果显示，cTCur-LIP 可以有效地靶向缺血心肌，明显提高心肌梗死大鼠的治疗效果，但是姜黄素对于心肌梗死的治疗机制仍需进一步探究[26]。