CRISPR-Cas9筛选系统在病毒宿主作用因子鉴定中的优势

董海丽

（福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117）

病毒依靠宿主细胞完成其复制周期，它们利用宿主细胞膜表面受体及胞内辅助因子进入细胞并且利用宿主细胞代谢进行其基因组的复制，组装子代病毒体并传播。为了治疗和预防病毒感染，研究人员进行了基因筛查，而CRISPR-Cas系统正成为基因筛查中必不可少的工具。CRISPR-Cas系统应用广泛，是一种分子诊断工具，可用于功能性缺失的基因筛查。CRISPR-Cas9介导的基因组修饰可激活或抑制基因表达，并且有标记特定基因组位点的功能区域，从而准确编辑基因组[2]。目前，CRISPR-Cas9系统的特异性与可重复性使其成为一种认可度较高的基因编辑工具。近几年，CRISPR-Cas9全基因组编辑后的筛选系统已应用于病毒受体及其所需的宿主胞内辅助因子的鉴定，包括临床相关病毒受体，例如丙型肝炎病毒（HCV）受体、登革热病毒（DENV）受体[3]、寨卡病毒（ZIKV）受体、西尼罗河病毒（WNV）受体等[4]；也包括病毒入侵宿主细胞所需的胞内辅助因子，例如甲型流感病毒（IAV）入侵的辅助因子capicua（CIC）和人类免疫缺陷病毒（HIV）入侵的辅助因子酪氨酰蛋白质磺基转移酶2（TPST2）与溶质载体家族成员B2（SLC35B2）等[5]。

本文介绍了CRISPR-Cas9系统的应用，该系统能进行全基因组规模的敲除，筛选受体及胞内辅助因子，并且将CRISPR-Cas9系统筛选与单倍体细胞筛选（Haploid），酵母双杂交系统筛选，RNA干扰（RNAi）等其他遗传筛选技术进行比较，以增进我们对筛选技术的认识和优化相应的筛选方案。

1 CRISPR-Cas9 全基因组敲除系统

CRISPR-Cas9 系统是细菌和古细菌中进化出的适应性免疫防御系统，包括tracrRNA，crRNA 和Cas9蛋白。在三者共同介导下，发挥CRISPR-Cas9的靶向切割作用，该过程由三个不同阶段组成：识别、表达和切割，如图1。

图1 CRISPR-Cas9系统抵御外源核酸入侵宿主细胞

在识别阶段，外来核酸作为新的CRISPR间隔区定向整合到由重复序列分隔的CRISPR阵列中，从而产生入侵元件的遗传记忆。在表达阶段，CRISPR阵列转录成pre-crRNA，随后加工成包含间隔区序列与重复序列连接的成熟crRNA。在干扰阶段，crRNA通过互补的重复序列与tracrRNA结合形成复合物称为向导RNA（sgRNA），它引导Cas9核酸酶靶向切割外源入侵的DNA序列[6]。因此，CRISPR-Cas9系统被开发成一种基因编辑技术。

2013 年，张锋等设计了两种II 型CRISPR-Cas系统，证明了Cas9核酸酶在sg RNA引导下，CRISPRCas9系统可精确编辑哺乳动物细胞基因组，并设计多个sgRNA序列应用于同时编辑基因组中的多个位点，继而发展为CRISPR-Cas9全基因组敲除系统，该系统用于病毒筛选宿主细胞的互作基因[7]。

2 CRISPR-Cas9 全基因组敲除系统在病毒宿主作用因子鉴定中的应用

病毒通过一定的途径入侵宿主细胞，它利用宿主细胞提供的蛋白质与核酸“原料”进行自我复制，由于病毒与宿主细胞作用因子产生相互作用，导致机体出现一系列临床症状。这些“作用因子”可通过CRISPR-Cas9介导的全基因敲除系统鉴定出来。该系统是以设计不同的sgRNA作为一个包含两万个基因被敲除的质粒库，以慢病毒为载体进行基因组稳转后达到敲除效果的一个体系。在这个体系中，期望值是达到每个细胞中仅有一个基因的功能被破坏，再使用病毒侵染该体系作用下的细胞，获得抗病毒细胞。在这整个筛选过程中必须达到以下几个条件：必须因病毒在细胞内的扩增导致细胞死亡；由于每个过程都有可能导致sgRNA的丢失，因此要严格控制细胞数量以及sgRNA的使用量[8]。近几年，CRISPR-Cas9全基因组筛选应用于以下病毒作用相关基因的筛选：2016年，Kei Haga等使用CRISPRCas9系统筛选到CD300lf 与 CD300ld，它们是感染小鼠的诺如病毒（MNV）受体[9]；2018年，Michael S.Diamond等基于CRISPR-Cas9的全基因组筛选，确定了细胞粘附分子Mxra8是部分致关节炎的甲型病毒入侵受体[10]等。这些研究成果表明CRISPR-Cas9系统在基因筛查应用中已成为一种有力工具，它的广泛应用促进了我们对病毒致病机制的理解。

3 其他筛选技术在病毒宿主作用因子鉴定中的应用

单倍体细胞筛选是对培养的单倍体细胞系中的基因进行插入突变，使含有剪接受体位点的逆转录病毒基因陷阱可以整合到宿主基因组中，产生转录后的截短mRNA，从而破坏对应蛋白质的表达。目标蛋白表达的受阻对病毒复制产生显著影响，以此来识别病毒感染关键的宿主因子。人们利用单倍体遗传筛选已发现了埃博拉病毒和拉萨病毒是利用溶酶体蛋白作为受体[11,12]。

酵母双杂交筛选是通过真核生物转录调控过程所建立的体系。真核生物中基因转录需要包含DNA结合结构域和DNA转录激活结构域在内的转录激活因子的参与。只有这两个结构域在空间上充分接近时，才能发挥完整的转录活性，使下游基因得到转录。因此，酵母双杂交筛选是基于这两个结构域分别与待研究相互作用的两个蛋白构建融合质粒，转染到酵母中表达蛋白，若二者有相互作用，下游的报告基因得以转录，根据报告基因的表达情况，从而判断两个蛋白是否有相互作用[13]。研究人员利用酵母双杂交筛选到真核翻译起始因子（EIF4A2）与猪的胃肠炎冠状病毒（TGEV）的复制相关[14]；确定了层粘连蛋白受体（LAMR）与草鱼呼肠孤病毒（GCRV）外衣壳蛋白VP5有相互作用[13]。

RNA 干扰（RNAi）是由双链RNA（DsRNA）加工成短干扰RNA（SiRNAs）SiRNAs与靶mRNAs结合后切割引起的一种基因沉默形式[15]。2015年Asiel A.Benitez等应用RNAi确定抗黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）与甲型流感病毒（IAV）入侵相关[16]；Haoyang Li等运用RNAi筛选显示Toll4在对抗虾白斑综合征病毒（WSSV）感染中具有重要作用[17]。

4 CRISPR-Cas9 系统与其他筛选方法的比较

与其他筛选技术相比之下，CRISPR-Cas9全基因组筛选的优势体现在：可鉴定促进病毒复制的宿主作用因子和抗病毒宿主作用因子。在基因功能丧失的筛查中，CRISPR-Cas9敲除细胞系中的病毒受体基因，这使细胞系对病毒感染产生抵抗力；而在基因功能增强的筛查中，病毒受体在细胞系中过表达，这使病毒增强对细胞的感染[8]。CRISPR-Cas9与单倍体细胞筛选相比，单倍体细胞筛选也可用于全基因组基因功能缺失筛选，但二者最大的区别在于单倍体细胞筛选不适于用作基因功能增强的筛查，并且单倍体细胞筛选使用的细胞类型也受限；与RNA干扰筛选相比CRISPR-Cas9筛查通常有较少的假阳性，由于短干扰RNA长度受限，较容易干扰非靶基因表达，易脱靶；与酵母双杂交筛选相比，酵母双杂交筛选不能用于全基因组基因功能丧失的筛查与基因功能增强的筛查，并且仅限用于真核酵母中[11,13,18]。

如上所述，CRISPR-Cas9 与其他筛选技术相比之下尽显其优势（表1），尽管CRISPR-Cas9脱靶效率很低，但研究人员依旧在不断完善这个技术难题。

表1 各种筛选方案的比较

机制筛选后细胞表型基因功能影响设计脱靶效应适用的细胞类型CRISPR-Cas9敲除筛选产生出错的NHEJ，导致移码突变完全敲除基因，导致增强病毒感染增强每个基因设计3-6 条sgRNA SgRNA的不配对导致基因组中的脱靶切割大多数常见细胞单倍体筛选整合含有剪接受体位点基因导致截短的mRNA完全敲除基因，导致增强病毒感染增强每个基因设计525个独立基因缺失无单倍体细胞或近单倍体细胞RNA干扰筛选短干扰RNA靶mRNAs结合，导致其切割和降解基因表达的部分下调，病毒感染增强效果不明显每个基因4-6个短干扰RNA短干扰RNA的不配对导致脱靶mRNA大多数常见细胞酵母双杂交筛选基因的过表达产物分析两种蛋白质互作靶基因表达上调，导致增强病毒感染增强基因的过表达无真核酵母细胞

5 总结与展望

CRISPR-Cas9 系统作为基因工程方面的工具，开始改变生物医学研究，包括传染病、癌症和基因治疗。这种新的方法也被用来更好地理解病毒如何利用它们的宿主，并开发新的抗病毒方案。目前，在使用CRISPR-Cas9系统进行全基因组筛选时，还会出现以下问题：基因丢失的情况以及CRISPRCas9系统的脱靶效应，使这项技术在医学研究领域的应用有一定的局限性。针对这些出现概率极低的问题，后续的研究者也在不断完善，例如，在进行慢病毒的包装时，可通过加大sgRNA质粒库的使用浓度以及在使用慢病毒进行全基因组构建时，增加细胞数量来最大限度地防止基因丢失；而张锋等使用Cas9核酸酶突变体和成对的引导RNA的双重切割策略，可最大限度地减少脱靶切割，这也开始了CRISPR-Cas系统的完善[8,19]。通过对CRISPR-Cas9系统不断完善，相信未来一定可以在医学研究领域大放异彩。