miR-21对肝星状细胞的增殖和成纤维化的影响

酒精性肝纤维化是由于长期过度饮酒引起的肝纤维增生性疾病；在此过程中，静态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)被炎症介质激活，继而分化为成肌纤维细胞；而通过抑制HSC激活来抑制肝纤维化已得到广泛关注

。此外，研究发现，miR-21在肺纤维化小鼠肺组织中表达上调，促进了肺纤维化进展

。然而，miR-21在肝中是否有相似作用，未见报道。因此，我们通过调节miR-21的表达来探讨miR-21对HSC的增殖和成纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1.1 细胞：大鼠HSC-T6购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂及来源：DMEM高糖培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司。一抗：PCNA(sc-56)、TGF-β1(sc-74511)、Smad3(sc-101154)、α-SMA(sc-53142)、CTGF(sc-101586)购自Santa公司，二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠和兔抗小鼠购自北京中杉金桥生物公司，Lip-lofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自索莱宝,本实验经本院伦理委员会批准，批号：HNKJDXDYFSYY20150009。

3）加强专业节能监测机构建设。为了加大对所属单位节能工作的监测和监督管理力度，中国海油2007年成立了集团公司节能减排监测中心，专门从事海上油气田、炼油、化工企业及其相关领域的节能减排监督监测、审计及管理与技术咨询工作。该中心不断加强自身组织、技术、资质、实验室设施建设，圆满地完成了各项审计、监督监测任务。

1.2.1 细胞培养：用含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养液，在37 ℃，体积分数为5% CO

和饱和湿度下培养，每日换液，待细胞生长至80%时(约3 d)，开始传代。

1.2.2 细胞传代：舍弃瓶中的培养液，用PBS洗3次，再吸尽PBS后加入1 ml质量浓度为25 g/L的胰蛋白酶溶液，盖上瓶盖，十字晃动培养瓶，使胰酶能充分接触所有的细胞，在倒置显微镜下观察细胞状态，待细胞被全部消化下来后，迅速加入2 ml含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养液终止消化，轻轻吹打使团状细胞分散，按1∶4的比例进行传代。

酒精性肝病发病率呈逐年递增趋势，且随着病情的不断进展，可发展为肝硬化、肝纤维化、酒精性肝炎等，对患者身心健康产生不良影响

。其中，酒精性肝纤维化(alcoholic hepatic fibrosis，AHF)临床以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过量沉积于肝脏内为主要病理特征

。目前，针对AHF尚无特效方法治疗，多以戒酒、营养支持和抗肝纤维化药物治疗为主

。

1.2.3 脂质体介导细胞转染：(1)种板：将HSC-T6细胞培养至80%～90%后消化收集细胞，以1×10

ml

的密度种入6孔板，放入37 ℃、体积分数为5%的CO

、饱和湿度的恒温细胞培养箱培养过夜。(2)转染：① 取Liplofectamine 3000转染试剂7.5 μl×6，加无血清DMEM培养基125 μl×6，混匀；室温静置5 min。② 取miR-21 mimic 5 μl×6或miR-21 inhibitor 10 μl×6，加无血清DMEM培养基125 μl×6 μl，混匀；室温静置5 min。③ 将①加入②中，混匀；室温静置孵育20 min，20 min后分别等量加入细胞6孔板；十字晃动使复合物匀散开。④ 放入37 ℃、体积分数为5%的CO

、饱和湿度细胞培养箱培养4～6 h后更换新鲜的含血清DMEM培养液。

miR-21是一个与纤维化疾病紧密相关的miRNA，其靶基因是ADAMTS-1。研究发现，miR-21在肺纤维化小鼠肺组织中表达上调，并且miR-21过表达通过靶向沉默ADAMTS-1促进肺成纤维细胞增殖、转化以及胶原蛋白合成

，提示miR-21可能是一种促肺纤维化因子。但在肝中是否也有此作用，值得探讨，本研究采用了miR-21的模拟物和抑制剂来调控HSC中的该基因的表达水平，进而研究miR-21对HSC的增殖和成纤维化的影响，从而在细胞水平上，为临床研究肝纤维化提供理论支持。

正常组HSC的增殖活力值正常，酒精组的HSC 12 h时细胞增殖活力值明显比正常组高(

<0.01)；miR-21模拟物组比酒精组高(

<0.05)，而miR-21抑制剂组比酒精组显著降低(

<0.01)(见图1)。这说明miR-21能够显著促进HSC的活化增殖。

1.2.4 HSC活化：转染48 h后，更换细胞培养液为含100 mmol/L乙醇、含质量浓度为100 g/L血清的DMEM培养液；放入37 ℃、体积分数为5%的CO

、饱和湿度细胞培养箱培养48 h，即可将HSC活化。100 mmol/L乙醇的配制方法：先配制1 mol/L的乙醇储存液，将583 μl的无水乙醇加入10 ml的含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养液；使用时将储存液稀释10倍即可。

2 结果

1.2.6 Western blotting检测:Western blotting检测细胞蛋白PCNA、TGF-β、Smad3、α-SMA、CTGF的表达变化，提取细胞蛋白做Western blotting，方法：取出培养皿，吸尽培养液，用预冷的PBS洗涤3次后，将残留的PBS吸干净，加入总体积为100 μl的蛋白裂解液(PMSF的比例为1∶100)；用细胞刮刀刮细胞，每处均刮到，吸尽液体于1.5 ml的EP管里，冰上裂解30 min，每5 min涡旋1次；再用预冷的离心机1.48×10

，20 min，4 ℃；最后，吸取上清液入EP管，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。加入4×蛋白上样缓冲液后混匀，放入沸水中煮5 min后冰上冷却，放入-20 ℃保存。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分别检测PCNA、TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF蛋白，用湿转法进行转膜，质量浓度为50 g/L的奶粉37 ℃封闭1 h；一抗(1∶500)，4 ℃过夜；二抗(1∶500)，37 ℃孵育1 h后用曝光机(Tanon 4600购自上海天能科技有限公司)进行曝光；最后，使用Gel Pro 4.0软件对蛋白条带进行分析，内参为β-actin。目的蛋白的相对表达值=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

在这两种应用中，耐火性很重要。标准EN ISO 9239-1的B2测试要求燃烧距离小于150 mm。木材泡沫试样(包括长纤维和短纤维)都通过了测试，燃烧距离和火焰持续时间相同。当木材泡沫与金属结构结合时，在复合板材中，燃烧距离和火焰持续时间显著减少。

为进一步验证改进算法可行性，选用较为复杂的真实海洋环境地图对改进算法进行仿真，算法于第50代、第80代左右增加局部网格密度。最终寻优结果见图10。其适应度成长曲线见图11。

3 讨论

任何职业劳动和职业教育都是以职业的形式进行的。高等职业教育属于职业教育，自然“职业性”应是其培养目标定位的基本内涵。项目式教学以学生将要从事的工作岗位对职业能力、知识结构的要求，以岗位的知识、能力、素质为出发点，作为设计项目教学内容的主要依据。学生学完一个项目，就能掌握一种技能；学完若干个项目，就能掌握职业岗位工作所要求的一项综合技能[6]。

1.2.5 CCK8检测细胞增殖活力：正常培养的HSC细胞即正常组，经乙醇活化48 h的细胞即酒精组，经转染miR-21 mimic 48 h且之后乙醇接触48 h的细胞即模拟物组，经转染miR-21 inhibitor 48 h且之后乙醇接触48 h的细胞即抑制剂组分别种入96孔板里，每孔50%～60%的细胞，每组5个复孔，重复3次，每次1个6孔板。细胞贴壁且形态长出来后，吸尽培养液，分别加入100 ml含有10% CCK8的含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养液，并且均分别增加一组即只含有10% CCK8的含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养液但不含细胞的空白组。均放入37 ℃、体积分数为5%的CO

、饱和湿度细胞培养箱中继续孵育，细胞贴壁后于0 h、12 h依次用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

PCNA、TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF在酒精组的表达量明显比正常组高(

<0.05)，在miR-21模拟物组中的表达量比酒精组高(

<0.05)，而在miR-21抑制剂组中的表达量则比酒精组明显降低(

<0.05)；表明miR-21能够通过调节TGF-β1/Smads信号通路和相关因子的表达促进HSC的增殖与活化，从而促进肝纤维化的进展。

CCK8研究结果表明：miR-21的抑制剂能够显著降低激活的HSC的增殖，抑制纤维化的进展；miR-21的激动剂则加剧了HSC的激活，使其增殖活力比活化后的酒精组高。说明miR-21对HSC的增殖和活化具有促进作用，促进纤维化的进展。

下位机与服务器间的通讯由USR-WiFi232B模块完成。该模块与服务器约定好通信协议，数据和指令的传输依靠通讯协议完成。一方面，运用C语言软件编写代码将传感器实时采集各项环境参数送至单片机依据通讯协议处理并送至WiFi模块接口继而由WiFi模块的射频发送到服务器端解析处理。另一方面，从WiFi模块收到的数据经过UART串口发送给单片机，在单片机上写好标准串口AT控制命令。

蛋白印迹结果中，PCNA是增殖细胞核抗原，是反映细胞增殖活性的一项指标

。酒精组的PCNA表达量明显比正常组高，说明乙醇接触诱导了HSC的增殖；模拟物组表达量进一步升高，说明miR-21的增加进一步促进了PCNA的增殖，而抑制剂组的PCNA的表达量降低，则说明了miR-21抑制剂抑制了PCNA的增殖；表明miR-21具有促进HSC增殖的作用。

α-SMA被认为是HSC激活的标志性蛋白并与肝纤维化有高度的相关性

。此外，有研究表明，通过降低α-SMA的表达可实现减少HSC的活化数量，而抑制肝纤维化的进展

。而CTGF是结缔组织生长因子，有研究表明，肝纤维化和肝硬化患者体内的CTGF表达明显升高，且与肝纤维化的程度呈正相关

。而在体外培养的HSC中发现，CTGF信使RNA水平显著增加，这表明CTGF可能是刺激HSC活化增殖的关键因子之一

。此外，有研究发现，通过抑制CTGF的表达能阻断TGF-β1/Smads信号通路，进而阻断肝纤维化的发生、发展

。这些与我们的研究结果一致，我们的蛋白印迹结果表明：α-SMA和CTGF在酒精组的表达量比正常组的表达量高，而在模拟物组则进一步增加，在抑制剂组则减少；这说明了miR-21的上调能够促进α-SMA和CTGF的表达，促进HSC的增殖、促进纤维化的进展；而miR-21的下调能够降低α-SMA和CTGF的表达，从而抑制HSC的增殖和成纤维化。

TGF-β1是肝纤维化病变过程中关键的细胞因子之一。其中TGF-β1/Smad3信号通路是TGF-β信号传导调节HSC活化促进ECM生成的主要途径

。我们的免疫蛋白印迹结果显示：酒精组的TGF-β1和Smad3的表达量明显比正常组高，说明了乙醇诱导了HSC的活化，促进了TGF-β1/Smad3信号通路的激活；模拟物组的TGF-β1和Smad3的表达量进一步增加，说明miR-21模拟物进一步促进了TGF-β1/Smad3信号通路的激活，促进了肝纤维化的进展；而抑制剂组的TGF-β1和Smad3的表达量明显降低，说明了miR-21抑制剂抑制了TGF-β1/Smad3信号通路，抑制了肝纤维化的进展。

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miR-21能够促进HSC的增殖和成纤维化，而抑制miR-21的表达，有望能够减轻或延缓酒精性肝纤维化的进程。

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