生化汤对产后气虚血瘀大鼠静脉血栓栓塞症的防治机制研究

何 珏，郝小白，张 燕，徐 妍，李 虹，盖 云，娄 玉， 朱 怡

(1. 上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200137；2. 上海和睦家新城医院，上海 201206)

静脉血栓栓塞症是指血液在静脉内不正常地凝结，使血管完全或不完全阻塞，属静脉回流障碍性疾病，包括深静脉血栓形成和肺血栓栓塞症，其形成的基本要素为高凝状态、血管内皮损伤和静脉血流淤滞。孕产妇静脉血栓栓塞症的发病率与病死率显著高于同龄非孕产妇，其中产后静脉血栓栓塞症的发病率为0.08%～0.71%[1-4]，因此，产科静脉血栓栓塞症日益被重视。本病常急性发作，以下肢深静脉血栓形成最为常见。产后给予低分子肝素抗凝治疗是首选抗栓预防方法，但抗凝治疗需长期按时皮下注射，并动态检测部分活化凝血酶原时间(APTT)，调整药物维持剂量，因此许多产妇在产褥期较难接受。中医古籍虽无静脉血栓栓塞症相对应病名，但根据其临床表现，可属“脉痹”“瘀血流注”等范畴。明医家王肯堂在《证治准绳》中记载妇女产后“腰间肿，两腿尤甚，此瘀血滞于经络”，瘀血“流注四肢或注股内，痛如锥刺或两股肿痛”，首次记录了女子产后下肢深静脉血栓形成的医案，并以活血祛瘀为治。同期医家张介宾也在 《景岳全书》中有“产后瘀血流注……气凝血聚为患也”的类似记载。清唐容川在《血证论》中用“瘀血流注”来定义该病，描述了因为瘀血而导致肢体疼痛肿账的特点，并指出“瘀血流注，亦发肿胀，乃血变水之证”，“瘀血流注，四肢疼痛肿胀，宜化去瘀血，消利肿胀”。诸医家普遍认为，静脉血栓栓塞症的病机中血瘀贯穿始终，炎症反应可能是启动血瘀证变化和血栓形成的重要因素[5-6]。生化汤是经典名方，该方除可增强子宫平滑肌收缩外，还具有较强的抗炎、抗凝作用[7-10]。因此，本研究从细胞因子角度探讨了生化汤对产后气虚血瘀大鼠静脉血栓栓塞的防治效果及作用机制，现报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠36只，鼠龄10周，体重(200±50)g，购于中国科学院上海药物研究所实验动物中心，动物合格证号：20170012010215。SPF级环境饲养，动物处置按相关伦理规定。

1.2实验药物及试剂、仪器 生化汤(由当归、川芎、炮姜、桃仁、炙甘草组成)由万仕诚药业有限公司提供,根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表折算成临床成人等效剂量给药；盐酸肾上腺素由上海禾丰制药有限公司提供。二甲苯、乙醇均购自国药集团，冰醋酸购自上海试剂一厂，苏木素、伊红、钾明矾和氧化汞均购自武汉拜意尔公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒、血管内皮生长因子(VEGF)检测试剂盒、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)检测试剂盒和D-二聚体检测试剂盒均购自R&D公司。石蜡包埋机、石蜡切片机均购自美国Leica公司，正置荧光显微镜为Leica DM 4000B，图片采集系统为Olympus DP71。

1.3实验方法 大鼠适应性喂养1周，参照文献[11]，将雌、雄鼠以2∶1的比例合笼，次晨行阴道冲洗液涂片发现精子的当天为妊娠第1天，未受孕的雌鼠次日再次合笼，最终保证每组孕鼠不少于5只。确定妊娠后,分笼喂养至自然分娩。随机取产后正常大鼠5只作为正常组，其余大鼠根据“劳则耗气”“寒凝血瘀”的中医理论制备产后气虚血瘀模型：从产后第1天开始每日9:00分批置于水槽内(水深约45 cm，将其置于4 ℃冰水中)，以木棒拨打强迫其不断游泳20 min，浸泡捞出后毛巾擦拭并电动吹风机吹干，放回笼中，注意保温，连续14 d。将造模成功大鼠随机分为模型组、生化汤中剂量组、生化汤高剂量组，每组5只。每日8:00—9:00，生化汤中、高剂量组分别给予含生药13.5 g/(kg·d)和20.25 g/(kg·d)的生化汤药液灌胃，正常组和模型组均给予等量蒸馏水灌胃，1次/d，连续灌胃14 d。末次灌胃30 min后，于各组大鼠背部皮下注射0.8 mL/kg盐酸肾上腺素。

1.4观察指标及方法

1.4.1舌象 灌胃第14天，参照中医观察法观察各组大鼠舌色、舌苔和舌质，并拍照记录。舌色分为淡、微红、淡红、红和绛5种，舌苔分为少苔、黄苔、厚白苔3种，舌质分为红蕴、细嫩、干涩和湿腻4种；采用非临床研究组织病理图像数据自动定量分析管理系统对舌象图像进行分析，测定舌乳头密度、菌状乳头密度、顶端舌苔厚度和底端舌苔厚度。

1.4.2血清TNF-α、VEGF、ICAM-1和D-二聚体水平 盐酸肾上腺素注射后立即处死各组大鼠，腹腔静脉采血，使用相应的检测试剂盒检测TNF-α、VEGF、ICAM-1和D-二聚体水平。

1.4.3子宫组织HE染色情况 收集各组大鼠子宫，进行石蜡包埋、切片，对切片进行HE染色，在荧光显微镜下观察和拍照。

2 结 果

2.1各组产后大鼠肉眼观察舌象表现 正常组大鼠舌色淡，舌苔少苔，均匀铺被，舌质红蕴；模型组大鼠舌色绛色，舌苔厚白，舌质湿腻；生化汤中剂量组大鼠舌色红，舌苔少，舌质细嫩；生化汤高剂量组大鼠舌色淡红，舌苔少，舌质细嫩。见图1。

图1 正常组和产后气虚血瘀各组大鼠干预14 d后舌象

2.2各组产后大鼠镜下观察舌象病理情况 与正常组比较，模型组大鼠的舌乳头密度和菌状乳头密度均明显降低(P均<0.05)，顶端舌苔和底端舌苔厚度均明显增厚(P均<0.05)；与模型组比较，生化汤中、高剂量组大鼠的舌乳头密度和菌状乳头密度均明显增高(P均<0.05)，顶端舌苔和底端舌苔厚度均明显变薄(P均<0.05)，生化汤中剂量组与生化汤高剂量组各项比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和产后气虚血瘀各组大鼠400倍镜下舌象病理情况

2.3各组产后大鼠血清TNF-α、VEGF、ICAM-1及D-二聚体水平比较 模型组大鼠血清TNF-α、VEGF、ICAM-1、D-二聚体水平均明显高于正常组(P均<0.05)，生化汤中、高剂量组均明显低于模型组(P均<0.05)，且生化汤高剂量组均明显低于生化汤中剂量组(P均<0.05)。见图2。

图2 正常组和产后气虚血瘀各组大鼠干预14 d后血清TNF-α、VEGF、ICAM-1、D-二聚体水平

2.4各组产后大鼠子宫HE染色表现 正常组大鼠子宫切片中无静脉血栓栓塞形成，模型组大鼠子宫切片中见静脉血栓栓塞形成，生化汤中、高剂量组中均未见明显静脉血栓栓塞形成。见图3。

图3 正常组和产后气虚血瘀各组大鼠干预14 d后子宫组织HE染色表现(×200)

3 讨 论

产妇分娩过程中往往伴随麻醉镇痛、剖宫产、产褥期长期卧床等因素，产后出现下肢静脉血栓概率增加，若不及时干预，待血栓形成脱落，便危及生命。“治未病”理论最早见于《黄帝内经》，是中医学重要的防治思想。“未病先防”“既病防变”是其基本核心，强调通过节饮食、慎起居、畅情志及膳食、药物等多种治疗方法，调节身体气血阴阳平衡，达到“正气存内，邪不可干”的目的。从临床实践来看，“治未病”理念体现在防治疾病于未生、未成、未发、未传和未变等多个方面[12]。因此从病因入手，积极改善体质，消除疾病诱因，可防止疾病因子对人体的侵袭，达到预防疾病的目的。

中医理论认为妇人产后处于“血不足、气亦虚”的状态，因产时耗气、汗出，产伤或失血过多，产妇元气受损，气血不足，百脉空虚；宫内瘀血胞衣内阻，旧血不去，新血不得归经。因此，产后病是在气血津液虚损的基础上发生的，故具有“多虚多瘀”的病理特点，虚为本,瘀为标。且产后腠理疏松，阳气不足，风寒外侵，阴寒内盛，故又见血虚寒凝，瘀血内停，则瘀更甚，形成虚-寒-瘀的恶性循环。因此，气虚血瘀是产后病的病理本质，临证多见面色白、少气懒言、神疲乏力、少腹疼痛、畏风畏寒、舌质紫暗、苔厚腻、脉细涩等。相关研究表明，血瘀与炎症关系密切，血瘀证的病理因素包括微循环改变、炎症损伤、代谢障碍及组织增生等，其中炎症损伤导致的渗出、变质、增生在血瘀证的病理改变中有着重要的意义[13]。在形成血瘀证的过程中，炎症因子可直接作用于血管内皮细胞，造成内皮损伤，影响血管通透性，导致炎症的渗出、增生，使血小板活化致血栓形成，亦可直接引起局部的多核白细胞聚集和激活释放炎症介质，并通过诱导黏附因子、白细胞介素、前列腺素E2等的合成与释放进一步加剧炎症反应，造成局部血液循环障碍(血瘀) 程度的加重[14-15]。

明清以来，众多医家主张“产后多虚、产后多瘀、产后多寒”的病因病机，提出“宜补、宜化、宜温”的治法治则，以温养立论。古方生化汤具有养血祛瘀、温经止痛之功效。方中重用当归、桃仁补血活血，化瘀生新；川芎活血行气止痛；炮姜温经散寒止痛；炙甘草调和诸药。此方取义于产后血虚，本当培补，然瘀血不去，新血不生，治宜养血化瘀，使新血生，瘀血化，故名“生化”，被称为“产后圣药”。胡小勤[16]实验研究表明，生化汤可以抑制大鼠血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，具有明显抗血栓作用。之后的相关实验研究发现，生化汤能明显降低大鼠的血小板黏附性，减轻血栓湿重，抑制体外血栓形成，可改善大鼠子宫微循环，具有良好的活血化瘀及抗血栓形成作用[17-18]。梁思爱等[19]研究发现，空气波压力循环治疗仪联合生化汤治疗剖宫产后下肢深静脉血栓的效果优于单独使用仪器治疗。对生化汤组成成分的研究发现，当归中主要成分阿魏酸钠可以通过抑制内皮细胞内NF-kB的活化，抑制由TNF-α引起的ICAM-1含量升高[20]；川芎中主要成分川芎嗪可以抑制脑缺血再灌注后TNF-α的表达，从而抑制黏附分子和iNOS的表达[21]。

中医诊治以望、闻、问、切四诊辨证施治为特色，中医舌诊在辨证用药上至关重要。气虚寒凝血瘀证舌象多以舌质紫暗、瘀斑，舌底络脉迂曲，舌苔白厚腻，边有齿印等为特征。本实验肉眼观察到，产后气虚血瘀大鼠经生化汤干预后舌质由瘀紫转红润、舌苔由厚腻转薄白，微病理显示舌乳头密度和菌状乳头密度增高，顶端舌苔和底端舌苔厚度变薄，体现血瘀本质的改善。另外生化汤中、高剂量组血清TNF-α、VEGF、ICAM-1、D-二聚体水平均明显低于模型组，子宫切片中无明显静脉血栓。表明生化汤可同时抑制炎症因子和凝血因子释放，抑制机体“炎症”和“凝血”两大生理性防御系统的功能亢进，从而改善产后瘀、虚的病理本质，防治产后静脉血栓栓塞症。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。