从氧化损伤标志物论述氧化应激与儿童孤独症谱系障碍

崔润芝，史正刚，霍曼，赵志英，谈慧媛，尉苗苗，冯鹏，尚菁

（甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

儿童孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一种异质性的儿童神经发育障碍性疾病，多起病于婴幼儿时期，2013年美国颁布的《精神疾病诊断与统计手册》第5版（DSM-V）列出其有社会沟通与交往障碍以及重复刻板行为两大核心缺陷，这些症状严重影响他们在学校、工作和其他生活领域的正常运转能力。随着社会生活环境和家庭结构的变化，其患病率逐年上升，世界卫生组织（WHO）通过在占人口16%的国家进行研究，估计全球儿童ASD 患病率为0.76%［1］。最新的美国疾控中心报告显示，2018年美国8 岁儿童的ASD 总患病率为1/44（2014年为1/59，2016年为1/54），且男女比例为4.2∶1［2］。复旦大学王艺教授团队研究［3］显示，ASD 在我国儿童中的患病率为0.7%。ASD在其病因和表型上都是异质性疾病，这种异质性使得对其发病机制的研究非常有难度。有研究结果表明［4］，ASD 的潜在病理、生理学可能与氨基酸、反应性氧化应激、神经递质和微生物群-肠-脑轴的改变等有关。目前已有许多研究为ASD 患者的氧化应激（oxidative stress，OS）水平升高和抗氧化能力降低提供了证据。因此，本文主要从氧化损伤标志物论述OS与ASD之间的关系。

1 氧化应激

氧化应激（OS）被认为是促氧化剂和抗氧化剂之间的失衡状态导致活性氧（ROS）或活性氮（RNS）过量而引起的细胞损伤［5］。其特征是产生过多的自由基，抗氧化剂水平下降，氧化剂/抗氧化剂比例失衡，即生物体内ROS和内源性抗氧化剂的产生不平衡［6］。各种疾病及正常的衰老过程都会增加OS，并产生ROS，导致细胞氧化还原系统发生改变，最终导致组织损伤和细胞死亡［7］。普通成年人大脑约占体质量的2%～3%，占总血流供应的20%，大脑以大约1.5 mmol/（min·g）的速率利用氧气，脑的氧耗量占机体总氧耗量的23%，由于其高氧状态，致使大脑特别容易受到ROS 的影响［8］。所以，主要精神疾病的发病机制都与OS 密切相关，比如阿尔茨海默病［9］、唐氏综合征［10］、抑郁症［11］等。

另外许多遗传和环境因素在ASD 的病因学中起着至关重要的作用，但尚未形成共识。有学者认为，ASD 可能因遗传和环境因素之间的相互作用引起，而OS 在两者之间起桥梁作用［12］。在涉及ASD 发病机制的许多因素中，OS已被认为是最具临床证据性的潜在机制［13］，特别是在发育的早期阶段［14］。

2 氧化损伤标志物与ASD的相关性

ASD 在神经生物学中被认为与氧化应激有关，如活性氧和脂质过氧化水平的增加，以及氧化应激其他指标的增加。因ASD 患儿细胞内和细胞外的谷胱甘肽水平失衡和谷胱甘肽储备能力下降，确诊患儿被认为更容易受到氧化应激的影响。多项研究表明，氧化还原失衡和氧化应激是ASD 病理、生理的重要组成部分［15］。当氧化剂超过抗氧化防御时，生理系统就会遭受OS，导致生物分子及功能出现障碍，身体中的脂质、蛋白质、核酸等都会受到氧化损伤。目前存在许多用于检测尿液、血液、呼吸和器官组织样品中的氧化副产物的分析方法。氧化脂质及其蛋白质化合物通常用作氧化生物标志物。血液和尿液是人体生理、病理过程（包括大脑）的整合物质和客观反映，因受医学伦理学限制，相关的氧化损伤标志物客观上不能在脑组织中得到测量。因此，学者们对氧化应激状态标志物的研究只局限在外周。本文只论述血液和尿液中常见的氧化损伤标志物。

2.1 脂质过氧化（LPO）标志物

脂质过氧化（LPO）由自由基与多不饱和脂肪酸连锁反应引起，导致产生具有剧毒的LPO 和烃聚合物。LPO 水平通常使用硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定法测量其最终产物丙二醛（MDA）和类似物的浓度［16］来评价。LPO的常见标志物是丙二醛（MDA）、4-羟基壬烯醛（HNE）和F2-异前列腺素。LPO 增加与线粒体功能障碍、神经元损伤、血小板活性异常和ASD血流改变有关［17］。使用TBARS 检测的研究［18］发现，与健康对照组（n= 19，30，26）相比，ASD 儿童（n= 19，30，27）的LPO 增加。一些报告表明，ASD 患者其他LPO 标记物水平增加，证实了ASD 患者OS 水平的增加。JAMES 等［19］和AL-GADANI 等［20］报道，与发育正常的非ASD 兄弟姐妹相比，ASD 儿童血液中的LPO 更高。在健康人中，LPO 通常由红细胞中存在的各种抗氧化酶的活性联合控制，在ROS 产生过多的情况下，如自闭症，控制效能欠佳。研究发现［18］，与对照组相比，ASD 患者组的红细胞TBARS 水平增加了2～3 倍，这表明ASD 患者膜结构中的LPO 水平可能增高，因此尽管抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性增加，氧化应激仍然存在。

2.1.1 丙二醛

丙二醛（MDA）是自由基攻击细胞膜产生的LPO，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，能够反映机体LPO 水平，从而间接地反映体内受到OS 损伤的程度。MDA 在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶的活性，被用作LPO 标记物。高水平的MDA 被认为是6 岁以上ASD 儿童氧化应激的生物标志物［21］。一项研究表明［22］，15 名ASD患者中有13 名（87%）患者的血浆MDA 含量高于正常人。YUI 等［23］研究发现ASD 组血浆MDA-LDL 水平、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸（DHA）水平及DHA/花生四烯酸比值均显著高于对照组，血浆SOD 水平显著低于对照组，并认为DHA和血浆MDA-LDL水平之间的这种联系可能有助于ASD患者的行为。

2.1.2 F2-异前列腺素

F2-异前列腺素是细胞膜上花生四烯酸受活性氧自由基作用发生脂质过氧化反应而产生的一系列类似前列腺素F2 的化合物，被认为是OS 和LPO 的可靠生物标志物［24］。在尿液中排泄的F2-异前列腺素及其代谢物是化学上稳定的化合物［25］，并对膳食摄入的脂质不敏感。其中，8-异前列腺素F2α（8-isoPGF2α）由于其稳定性，是LPO 的一个特别可靠的指标。体液中F2-异前列腺素的测定被认为是在体内通过自由基途径测定LPO的可靠的生物标志物［26］。MOSTAFA等［27］研究表明，ASD 儿童血浆F2-异前列腺素水平显著高于健康对照组，血浆谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低。88.64%的ASD 儿童由于血浆F2-异前列腺素升高和/或谷胱甘肽过氧化物酶减少而发生OS。

2.1.3 乙酰-赖氨酸加合物

乙酰-赖氨酸加合物（hexanoyl-lysine adduct，HEL）是一种新型LPO 修饰的赖氨酸残基。HEL 是通过氧化-6 脂肪酸（如亚油酸或花生四烯酸）氧化修饰而形成的［28］。HEL 可以作为LPO 初期阶段的一个有用的生物标记物［29］。ASD 患儿的尿HEL 水平也被发现升高［30］，YUI 等［31］认为ASD 患儿的HEL 水平升高与抗氧化能力下降有关。IMATAKA 等［32］研究了19 名ASD 患者［年龄（10.8±5.2）岁］和10 名年龄匹配的健康对照组［年龄（14.2±7.0）岁］的尿液和血浆生物标志物与行为症状之间的关系，使用异常行为检查表（ABC）评估行为症状，与对照组相比，ASD组尿TAC水平显著降低，尿HEL水平显著升高。

2.2 蛋白质氧化

蛋白质作为ROS 的主要靶点之一，在自由基及相关氧化物的作用下，使血浆或细胞中的蛋白质与某些特定的氨基酸残基发生反应，导致蛋白质发生功能与结构上的改变［33］。自由基-蛋白质反应在体内可引起与许多病理过程相关的细胞结构的广泛损伤，如LPO、蛋白质及核酸等的氧化损伤。估计人血浆内参与过氧化氢反应的抗氧化物有10%～50%是蛋白质［34］，因此蛋白质氧化研究成为研究氧化应激及其损伤的重要内容之一。目前的研究表明，由ROS/RNS 引起的蛋白质氧化的损伤及衰老与阿尔茨海默病、帕金森氏病、ASD等疾病的发生均有关。

2.2.1 蛋白质羰基

蛋白质羰基（PCO）是目前应用最多的蛋白质氧化损伤标志物。ROS能通过各种氧化机制将蛋白质转换成羰基衍生物，故其成为反映蛋白质氧化损伤的敏感指标之一［35］。在对氨基酸残基的修饰中，PCO 的形成是蛋白质氧化的早期标志。YENKOYAN 等［36］测定了ASD 患者血浆中的高级氧化蛋白产物（AOPP）、PCO 水平等，证明了自闭症患者蛋白质氧化、DNA 损伤、炎症和线粒体超氧化物产生标志物升高之间存在关系的早期假设［37］。有报道称，阿曼苏丹国自闭症儿童的氧化应激指标NO、MDA 和蛋白羰基等水平升高，抗氧化蛋白如铜蓝蛋白、转铁蛋白等水平降低［38-39］。

2.2.2 二酪氨酸

酪氨酸是蛋白质氧化的主要结果之一。二酪氨酸（DT）是一种酪氨酸二聚体，由酪氨酸自由基衍生而来，由ROS、金属催化氧化、紫外线照射和过氧化物酶形成。DT 曾被认为是蛋白质氧化的良好指标［40］。当在尿液中测量时，它对氧化应激相关的病理条件呈现高敏状态［41］。DT作为待研究的生物标记物前景广阔，这一标志物的添加使研究氧化状态在人类健康和疾病中作用的现有工具多样化。ANWAR 等［42］观察38 例ASD 患儿和31 名年龄匹配的健康对照组，测定血浆和尿液中的蛋白糖化、氧化等加合物，结果与健康对照组相比，ASD 患儿血浆蛋白中DT 含量增加。研究指出［28］，ASD 诊断与更高水平的DT 表达相关，已被证实是儿童和青少年诊断ASD最具影响力的预测因子。

2.3 核酸氧化

8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）被公认为是DNA 氧化损伤的主要标志物。8-羟基-2'-脱氧鸟苷［43］是由羟基自由基，单线态氧和直接光动力作用形成的氧化损伤DNA的产物，可在组织、血清、尿液等标本中检测。8-OH-dG已被验证为动物模型中OS的生物标志物，但至目前尚未在人体研究中显示。既往研究也证实它是OS 引起DNA 损伤的敏感生物标志物［44］。DNA 修复能力的个体差异对尿液中8-OH-dG水平的影响仍然不确定，个体内变异性也未知，但这一生物标志物可以被用作监测工具。有研究结果提示，25（OH）D、CYP1B1、hs-CRP和8-OH-dG作为ASD早期诊断的生物标志物的可能性，且应联合使用使诊断价值最高化，但目前仍需进一步研究来评估这一假设［45］。

2.4 其他氧化损伤标志物

近年来，EFE 等［46］将动态硫醇/二硫化物稳态（DTDH）作为一种新的血浆氧化应激生物标记物，调查了60 名3～10 岁ASD 儿童和54 名正常儿童的血浆DTDH 参数，研究氧化剂-抗氧化剂内稳态受损在ASD 发病机制中的作用，结果显示ASD 儿童DTDH 紊乱，ASD患儿血浆二硫化物水平显著升高，而血浆天然硫醇和总硫醇水平显著降低。结果表明OS 增加与抗氧化能力降低和ASD之间存在合理关系。

自闭症中更多OS 的间接标志物包括内源性抗氧化酶（如GSH-Px、SOD）和谷胱甘肽降低、抗氧化营养素降低、有机毒素和重金属升高、黄嘌呤氧化酶和细胞因子升高以及NO 的增加等。其中关于内源性抗氧化酶及谷胱甘肽方面的研究报道较多，如GU 等［47］通过观察认为，与对照组相比，自闭症组GPx活性明显降低（P＜0.05）；PANGRAZZI 等［48］在讨论氧化应激如何支持大脑炎症和ASD 样行为时发现，与健康对照组相比，ASD 患者的SOD、过氧化氢酶、GPx 和GSH 水平较低；WANG 等［49］研究发现血清SOD 水平的降低可能与我国2～6 岁儿童ASD 的病理生理发展有关，可作为ASD 的独立危险指标；也有研究报道为保护机体免受氧化应激影响GSH-Px、SOD 水平可能会代偿性升高［18］。氧化生物标志物在ASD 临床管理中的应用已经开始，各种血液、尿液、粪便和呼吸测定法检测得出的氧化损伤标志物结果及水平可用于确定最佳剂量和营养素与其他干预措施的组合。FRUSTACI 等［50］研究发现，NO、MDA、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽及其前体、氨基酸、维生素、TBARS 和氧化还原酶是最受检查的相关参数。但OLESOVA 等［51］指出，ASD 和非ASD 组间的代谢组谱仅在学龄儿童中有统计学意义，而在学龄前儿童中没有统计学意义。

3 中医药治疗ASD与OS的相关性

中医古籍中并无“自闭症”或“孤独症”病名的明确记载，但据相关症状记载，ASD可被归入“语迟”“郁病”“无慧”“童昏”等范畴，且认为自闭症病位在脑，与心、肝、肾三脏密切相关，多因先天胎禀不足，后天失于调养，以致精血不足，脑髓失充而发病。

现代药理学研究已证实，中药有效成分可通过清除自由基、抑制脂质过氧化氢和调节抗氧化酶水平来增强细胞内SOD、CAT、GSH-Px 等活性、抑制ROS、MDA、LDH 等的释放，有学者从这一角度对单味药及复方有效成分进行了梳理［52］，相关单味药有补虚药（地黄、淫羊藿、人参、刺五加），行气活血药（川芎）；中药复方有地黄益智方、地黄饮子、加味四逆散等。杨培树等［53］研究发现当归、黄芪、丹参、鸡血藤水提物能降低大鼠血管平滑肌细胞上清液中MDA 及NO 的含量，具有抗OS 作用，并可通过协同作用发挥疗效。惠香香等［54］运用数据挖掘分析中药调控机体OS的用药特点，发现有效成分50 种，临床用药以补虚药和活血化瘀药为主，丹参、川芎、红花、黄芪、当归、人参、甘草位居前7 位。在配伍用药上，江晓宇等［55］采用重用熟地黄的引火汤加味联合行为干预治疗ASD 患儿；叶剑飞等［56］用通窍活血汤、地黄饮子、开心散等组成的抗闭1 号治疗ASD 患儿；马丙祥教授［57］重用黄芪合四君子汤治疗心脾亏虚证ASD 患儿，后加用四逆散辅助治疗；樊亚妮等［58］用白芍、甘草、远志、人参、茯苓、当归、川芎等制成静帅康胶囊、聪脑益智胶囊辅助治疗ASD 属心肝火旺证者，经治疗后，患儿相关症状均较前明显好转。史正刚教授［59］亦在早期研究中发现，参麦加味汤可降低新生大鼠缺氧缺血性脑病脑组织中的MDA 含量，提高SOD含量，增强脑组织内自由基清除酶类的活力。

研究发现，针刺治疗多种疾病的氧化应激拮抗作用可通过抑制炎性细胞活化、改善线粒体呼吸功能、减少铁离子超载、增强内源性抗氧化酶（如SOD、CAT 及GSH-Px）活性、减少细胞大分子（如脂质、蛋白质及DNA）的氧化损伤、调节与ROS 产生或消除相关的信号通路（Cyt C 和Nrf2 通路）等多种途径增强清除自由基能力以调控机体稳态。袁青等［60］从BNIP3介导的线粒体自噬机制出发，推断针刺对细胞自噬表达的增强可能是其治疗儿童脑病的机制之一。陈丽容等［61］通过动物实验发现针刺兴奋法可降低缺血、缺氧性脑损伤幼鼠脑组织中MDA、NO水平，提高GSH-Px水平，促进脑组织内代谢产物的清除，保护脑神经功能。程岩岩等［62］认为，“逆针灸”能通过提高血管性痴呆模型大鼠SOD的含量，降低ROS及MDA的含量而对模型大鼠起到抗氧化作用。KHONGRUM 等［63］研究发现激光针灸神门穴（HT7）可通过改变丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶活性水平而改善丙戊酸自闭症大鼠模型的自闭症症状。樵成等［64］对42 例心脾两虚证ASD 患儿采用针药联合治疗验证了通过抗OS治疗ASD的可能优势所在。

中医药治疗ASD临床应用广泛，中药对机体OS的相关调控作用已被证实，且在治疗ASD的配伍用药上与现代药理学研究高度呼应，但大部分中药配伍汤剂治疗ASD是否通过抗OS发挥作用仍不明确；针刺治疗疗效显著，但对针刺通过调节氧化损伤标志物来治疗ASD的临床研究和动物实验较少。未来亟需大量动物实验及临床研究从这两方面出发来精确验证这一观点。

4 小结

本文综述了氧化应激导致脂质过氧化、蛋白质氧化、核酸氧化而使机体代谢产生丙二醛、F2-异前列腺素、乙酰-赖氨酸加合物、蛋白质羰基、二酪氨酸、8-羟基-脱氧鸟苷等氧化损伤标志物，以及新的血浆氧化应激生物标记物动态硫醇/二硫化物稳态（DTDH），这些标志物都是自由基过量，抗氧化剂水平下降，氧化剂/抗氧化剂比例失衡的结果。亦阐述了当前中医药在治疗ASD上所体现的抗OS作用，并指出了未来亟需攻坚的方向。

OS在ASD 发展中的作用已经研究了几十年，越来越多的证据表明，ASD 的发病机制与氧化损伤产物的堆积和抗氧化代谢紊乱有关。通过比较ASD 患者与健康人OS 血液尿液，发现了大量标记物，且发现大多数标记物之间存在异质性，这是临床实践探讨的热点。由于缺乏ASD 的实验室检测金标准，使其早期诊断和初步干预都具有挑战性，目前的诊断方法主要靠对患者行为的临床评估，西医治疗上利培酮与阿立哌唑已获美国食品和药物管理局批准用于临床治疗，但长期大量使用的副作用明显［65-66］，尚无其余特定疗法。ASD 患儿家长经常转向有限的或无支持证据的治疗，包括行为、药理和替代疗法，但替代治疗的有效性证据目前仍无定论。更令人担忧的是，ASD 患儿家长可能会考虑接受无效的、侵入性的甚至有害的治疗。故从代谢组学出发，确定潜在的生物标志物，用于早期诊断ASD，并将其用于指导确定最佳剂量和营养素与其他干预措施的组合，监测临床个体治疗的指标［52］，来早期评估和治疗抗氧化状态以增加改善ASD 患儿预后的可能性，更快地推断ASD 的发病机制、治疗方案及早期预防，显得尤为重要。由此可见，大规模尝试研究抗氧化剂在自闭症中的作用也应引起学者广泛关注，相关内容仍需深入的证据、临床报告和研究。中医药在治疗ASD 上疗效明显，针刺发挥作用的相关机制已得到探析，但目前关于针刺治疗调节OS代谢产物的研究主要集中在阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症、脑卒中后抑郁等神经精神系统疾病上，对ASD 的针对性研究较少；内治法配伍用药上虽与现代药理学研究高度呼应，但具体机制仍不明确，今后可从上述两方面出发，以分子生物学及机体生化为切入点，同时进行大量动物实验及临床研究，为中医药治疗ASD提供循证医学依据，以期为ASD的预防、诊断及治疗提供新方法及新方向。