线粒体融合和裂变在眼科疾病中的研究进展△

王思文 李鹏飞 王从玉 鲍思洁 孙诚浩 管怀进

线粒体是多细胞生命不可或缺的组成部分，通过氧化磷酸化形式产生三磷酸腺苷(ATP)为细胞代谢提供所需的能量，因此常常被称为细胞的“能量工厂”[1-2]。此外，线粒体拥有动态变化的结构，能够通过裂变和融合这种形态上的变化和空间上的重新排列以适应细胞的需求，维持能量平衡。线粒体的这种控制其数量、大小、形状和在细胞内的分布特征被称为线粒体动力学[3-4]。融合和裂变之间的动态平衡是利用线粒体之间的物质交换来维持线粒体基因组的稳定以及通过线粒体自噬和线粒体生物合成来一起维持线粒体的质量控制[5]。因此，线粒体功能的正常运行是通过线粒体动力学(裂变/融合)和质量(生物发生/线粒体自噬)控制之间的动态平衡实现的。正常情况下，融合-裂变是平衡的，当细胞早期受到应激时，受损的线粒体会首先通过裂变和融合来维持其功能的正常运行，若未及时修复，线粒体自噬会参与维持线粒体质量控制[6]。随着研究的深入，有研究发现，线粒体动力学异常与细胞的衰老和凋亡密切相关[7-8]，目前，多项研究聚焦线粒体的动力学，调节与多种眼部疾病发生之间的关系，如年龄相关性白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变(DR)等。本文就线粒体裂变和融合与常见眼科疾病之间的调控关系进行综述。

1 线粒体裂变的分子机制

线粒体裂变主要由线粒体动力蛋白1(Drp1)调控，Drp1是属于动力蛋白家族的三磷酸苷(GTP)酶，包括一个N端GTP酶结构域，一个中间区和一个C端GTP酶效应域[9]。应激反应时，细胞线粒体会通过增加自身的裂变来清除有缺陷的线粒体以维持细胞内部功能的正常运行[10]，而线粒体裂变蛋白Drp1在此过程发挥重要作用，其作用机制如下：当线粒体外膜(OMM)上丝氨酸 616位点发生磷酸化后，线粒体外膜蛋白、线粒体裂变因子(Mff)与其他蛋白质一起募集位于细胞质的Drp1到OMM[11]；定位在线粒体以后，Drp1形成螺旋状结构，相邻梯级的GTP酶结构域就会靠近并触发GTP水解，诱导进一步的构象变化，从而驱动OMM收缩[12-13]，最终在线粒体周围形成一个环，将其收紧以形成2个独立的线粒体，介导线粒体外膜的裂变过程[7]。有研究显示，与线粒体外膜结合的蛋白也可以通过招募Drp1来启动线粒体裂变，如裂变蛋白-1(Fis1)、 Mff、线粒体动力学蛋白(MiD)-49和MiD51[11,14]。另外，除了OMM裂变机制外，线粒体内膜蛋白质线粒体蛋白18也被发现通过与OMM连接促进线粒体内膜(IMM)发生裂变[15]，它发挥作用的具体机制还有待进一步研究[7,16]。

2 线粒体融合的分子机制

线粒体融合是对轻度受损的线粒体进行潜在修复的过程[10]，主要是融合蛋白(Mfn)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)将两个线粒体内外膜进行融合形成一个线粒体的过程。Mfn和OPA1分别介导外膜和内膜的融合[17-20]。外膜融合蛋白Mfn有2种同工型：Mfn1和Mfn2，两者在结构上相似，N端区域包含一个GTP酶结构域和一个疏水性的七肽重复结构，称为HR1。C端区域包含第2个七肽重复域，称为HR2，两者之间存在一个长的跨膜结构域[21]。在线粒体外膜融合过程中，2个邻近线粒体外膜上的Mfn1和Mfn2相互连接以启动线粒体外膜融合，其作用机制如下：首先，Mfn1/2的C端螺旋在线粒体聚集过程中形成同源/异源二聚体，从而使两个相邻线粒体相互靠近[22]；其次，由于Mfn1和Mfn2融合蛋白的N端均包含GTP结合域[21]，所以，在与GTP结合的水解作用下，相邻的线粒体被GTP酶结构域的构象变化所驱动而完全融合[22]。

待线粒体外膜融合后，OPA1接着调节线粒体内膜的融合。OPA1蛋白是位于线粒体内膜上的跨膜蛋白，同时也是一种GTP酶，包括一个GTP酶结构域、一个中间区和一个C端GTP酶效应结构域[23]，因此，能够促进线粒体内膜融合的发生。线粒体融合机制十分复杂，目前尚不完全清楚，仍需进一步探究。因此，线粒体裂变与融合能够控制线粒体形态以满足细胞的特定需求，线粒体裂变能够通过分离无效线粒体为细胞提供更充足的能量[24]；代谢活跃的细胞通常具有相互连接的线粒体网络，融合的线粒体网络使代谢物质交换更加频繁，将膜电位从线粒体内膜的基质侧传递到内膜外，增加ATP产生，并减少活性氧(ROS)产生[25-27]。所以，任何一种OMM或IMM裂变蛋白的增多或融合蛋白的缺失均会导致线粒体网络过度碎片化，从而诱发细胞凋亡。因此，线粒体动力学的调节过程对于维持线粒体完整性和功能具有重要意义，裂变-融合的稳态失衡会导致线粒体功能异常，进而导致多种眼科疾病的发生。

3 线粒体融合和裂变与年龄相关性眼病

3.1 线粒体融合和裂变与年龄相关性白内障年龄相关性白内障(ARC)是当今国内外最常见的致盲性眼病，然而其病因和发病机制尚不清楚。分子生物学研究表明，自由基特别是ROS异常增高所造成的细胞内DNA氧化损伤而导致的晶状体上皮细胞(LECs)的损害和凋亡是ARC发病的分子基础[28]。ROS过度产生导致DNA氧化损伤，包括核DNA(nDNA)氧化损伤和线粒体DNA(mtDNA)氧化损伤。前期大量研究均聚焦ARC内nDNA的氧化损伤修复，结果证实，8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1基因(OGG1)，修复交叉互补基因6(ERCC6)和WRN等DNA氧化损伤修复基因表达在ARC中均显著降低[29-30]。然而，有研究证实，由于mtDNA位于线粒体内膜的电子传递链复合物内，更靠近ROS的主要合成点，并且mtDNA缺乏组蛋白保护，因此，相对于nDNA来说，LECs内部的mtDNA更容易发生氧化损伤[31]。此外，有研究证实，OGG1和ERCC6蛋白能够参与线粒体内mtDNA的损伤修复过程[32-34]。还有研究显示，在衰老大鼠的晶状体内mtDNA损伤重于nDNA损伤，并伴随DNA损伤修复基因表达降低，最终导致白内障的发生[35-36]。综上所述，若线粒体内氧化损伤未及时修复，随着年龄增加，mtDNA损伤不断累积，必将引起线粒体的动力学异常，因此，线粒体本身动力学调控维持LECs内线粒体的功能正常运行可能在ARC的发病机制中起重要作用。然而，目前ARC中对于线粒体动力学蛋白的异常变化研究尚缺乏，所以，ARC发病机制值得学者们深入探讨。

3.2 线粒体融合和裂变与青光眼青光眼是全球第二大致盲性眼病，其病理学特征表现为视神经乳头(ONH)轴突和视网膜神经节细胞(RGC)慢性退行性病变，导致视觉功能丧失。流行病学研究显示，青光眼患病率还在持续增加[37]，这表明青光眼的发病机制与人口老龄化直接相关[38]。近年来，多项研究证实，RGC轴突线粒体功能的正常运行在青光眼的发病机制研究中起重要作用[39]。有研究发现，在青光眼患者和SD大鼠ONH星形胶质细胞中以及在体外氧化应激诱导的ONH动物模型的星形胶质细胞中均发现线粒体过度裂变导致的线粒体功能异常[40]。在此，本研究综述了两种常见的青光眼动物模型中线粒体动力学的变化。

DBA/2J(D2)青光眼小鼠模型中，小鼠眼底表现出的RGC损伤与青光眼患者视神经病变相似，透射电子显微镜结果发现，在该模型鼠中，线粒体的嵴被破坏，表面积比野生型小鼠组小，这提示线粒体裂变明显增加[41]。随着分子生物学研究的深入，有研究发现，该模型中 A激酶锚定蛋白1的缺失通过下调线粒体膜上Ser637位点处Drp1磷酸化水平，从而导致Drp1表达增多，线粒体裂变增加，进而影响RGCs细胞存活[42]。Dai等[43]利用小梁网经角膜缘激光光凝术诱导创建了另一种SD青光眼模型大鼠，该模型大鼠表现出与人相似的高眼压(IOP)，随着IOP升高， RGC中ROS的产生和Drp1表达水平均显著增加，导致线粒体发生裂变，影响了细胞内新陈代谢速率，加速了RGCs的退行性病变。此外，在OPA1敲除的小鼠模型中，RGC 中的线粒体裂变增加[44-45]。Hu等[46]将腺相关病毒2型-OPA1注入高IOP青光眼模型大鼠的玻璃体内，结果显示，转染OPA1的大鼠视神经 RGC的线粒体融合增加，表面积增大，这表明线粒体融合蛋白OPA1表达升高促进线粒体融合可明显改善青光眼视网膜损伤。Kim等[47]研究通过青光眼D2模型鼠以及体外培养RGC发现， 高表达的Drp1通过促进线粒体裂变参与氧化应激通路的调控；此外，线粒体融合蛋白Mfn1和 Mfn2表达增加能够维持青光眼D2小鼠胶质层中线粒体的完整性来保护RGC轴突。

总之，青光眼神经变性病理过程中存在一个恶性循环，IOP升高产生氧化应激，氧化应激导致线粒体裂变和功能障碍，产生进一步的氧化应激。因此，青光眼的发生与线粒体的融合-裂变密切相关，深入了解线粒体动力学的调控机制，对未来青光眼的防治提供更多的选择。

3.3 线粒体融合和裂变与AMDAMD是一种影响视网膜中央部位黄斑的神经退行性疾病，是发达国家老年人群中最常见的致盲性疾病[48]。AMD与多种环境和遗传因素有关，其中年龄是较强的危险因素[49]。近年来，多项研究证实，视网膜色素上皮(RPE)功能障碍在AMD的发生发展中起着重要作用，生理状态下，RPE通过其上层与光感受器相互作用，下层与玻璃膜(Bruch膜)和脉络膜毛细血管相互作用，保持光感受器功能正常运行[50]。而随着年龄的增长和环境压力的累积，RPE 因功能失调而发生凋亡，这种病理学改变在AMD发生发展中起着核心作用[50-51]。然而，有研究发现， AMD患者中 RPE细胞的mtDNA 损伤水平显著增加[52]。因此，RPE细胞中的线粒体功能障碍可能是AMD 发生的始动因素，发生在患者视力丧失之前[53]。随着年龄的增加，AMD患者中，自由基清除系统能力下降、DNA修复机制受损等因素均会导致线粒体损伤。若线粒体不能通过自身的融合/裂变清除受损线粒体，一旦融合/裂变比例失衡，可能导致线粒体功能障碍。因此， 维持RPE细胞中线粒体的动力学稳态至关重要[53]。

研究发现，AMD患者的RPE细胞中线粒体裂变增多[54]，随后，为了研究抑制线粒体裂变对人RPE细胞(ARPE-19)氧化应激的影响，采用H2O2处理ARPE-19细胞导致线粒体裂变增多后，再使用线粒体裂变抑制剂1 (Mdivi-1)处理，结果显示，经Mdivi-1治疗后的细胞线粒体功能有所改善，细胞活力明显提高[55]。另一项研究显示，在诱导的损伤模型中，线粒体融合相关蛋白OPA1水平显著降低，而线粒体裂变蛋白Drp1水平明显升高，导致细胞凋亡加重[56]。上述研究均发现，线粒体裂变的增加会导致细胞凋亡发生，这提示线粒体动力学失衡会严重影响细胞存活率和生存质量。然而，有研究发现，在小鼠应激模型中，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通过增加线粒体裂变和线粒体自噬对光感受器和RPE均具有保护作用[57]。此外，Wang等[58]观察到在小鼠RPE中线粒体铁蛋白(FtMt)随年龄增加而增加，同时FtMt表达增加会诱导线粒体裂变，引起线粒体片段化，并诱导线粒体自噬，从而保护RPE细胞。

总之，线粒体动力学的调节能恢复线粒体的正常运行机制，诱导线粒体自噬清除受损的线粒体，在一定程度上会缓解因线粒体动力学异常而导致的线粒体功能障碍。因此，深入了解AMD发病机制中线粒体功能障碍的发生发展可能会促进其治疗的进展，但线粒体动力学调控和线粒体自噬选择性降解机制的具体调控仍需要不断探索。

3.4 线粒体融合和裂变与DRDR是糖尿病最具破坏性的并发症之一，是年轻人群失明的主要原因。作为一种普遍存在的微血管并发症，其特点是血-视网膜屏障的破坏[59]，伴随着血管内皮细胞和周细胞的脱落，内皮细胞基底膜增厚，血管渗漏,血管外的脂质和蛋白质沉积[60]。近年来，有研究发现，在DR患者RPE细胞中，随着线粒体裂变增多，线粒体的尺寸变小，从而使线粒体DNA稳定性下降，而线粒体形态的变化会影响线粒体功能；线粒体融合相关蛋白表达下降，裂变相关蛋白表达升高[61]，这提示线粒体动力学异常可能在DR的发病机制中起着至关重要的作用。

研究发现，在DR患者的视网膜样本、糖尿病大鼠的视网膜和高糖诱导的细胞模型中的线粒体融合和裂变基因的表达异常，提示RPE细胞内线粒体动力学失衡可能参与DR的发生发展[62-63]。Kim等[61]研究发现，RPE中融合蛋白Mfn2表达增加可以预防由高血糖引起的线粒体结构改变和功能障碍，抑制葡萄糖诱导的细胞凋亡，进而减缓DR的进展。此外，也有研究将大鼠RPE分别采用正常培养基和高糖培养基培养，再通过转染Fis1 siRNA或Drp1 siRNA进行靶向干预，后续通过一系列分子生物学研究发现，随着线粒体裂变减少，促凋亡蛋白Bax表达减少，抑制高糖诱导的线粒体裂变增加可以保持线粒体形态，并防止与DR相关的RPE凋亡。另外，有研究还对比了年龄匹配的非糖尿病对照组的眼球和DR患者的视网膜之间线粒体融合和裂变分子之间的表达变化，结果发现，融合蛋白Mfn2水平在DR患者的视网膜样本中降低，而且，同型半胱氨酸能够下调Mfn2表达，减少线粒体融合，同时也减弱线粒体自噬，使DR的患病风险显著增加[64]。褪黑素是一种强抗氧化剂，可以清除多种氧自由基，并激活其他抗氧化酶。有研究发现，褪黑素能够防止线粒体裂变引起的氧化应激[65-66]，并通过上调线粒体融合逆转线粒体损伤[67]。为观察褪黑素对视网膜的影响，Chang等[68]通过给予链脲霉素诱导的1型糖尿病小鼠口服褪黑素，结果表明，褪黑素不仅能够抑制线粒体裂变蛋白Drp1表达，而且参与调控线粒体自噬来维持线粒体质量，从而减少细胞凋亡。因此，褪黑素能够预防和治疗高血糖引起的体内模型和体外模型线粒体动力学异常，发挥神经视网膜的保护作用。

总之，线粒体动力学异常参与调控多种体内外DR疾病模型的形成过程，为DR 病理生理学机制提供了新见解。因此，未来针对融合和裂变分子靶向的研究有望阻止DR的发生发展，为早期治疗提供新策略。

4 小结

随着社会老龄化现状的加剧，亟需有效的方法预防或延缓如ARC、青光眼、AMD和DR等眼科疾病的发生发展。随着年龄的增加，当细胞内的线粒体质量降低时，受影响细胞中线粒体动力学的平衡就会被打破，导致线粒体融合或裂变，进而诱发多种眼部疾病的发生发展。因此，深入探究线粒体动力学异常在各种眼部疾病中的作用至关重要。但是，目前对维持线粒体质量控制系统正常运行的分子机制及其如何影响疾病的了解仍处于起步阶段，所以，深入挖掘线粒体动力学异常的生物学标志，在动物模型中进行干预验证，结合线粒体自噬进一步维持线粒体的质量，或许将为延缓眼部疾病的早期发生和发展提供新的治疗选择和研究方向。