银黄口服液制备过程中绿原酸含量稳定性考察*

冯 倩，张洪亮，庄华青，沈庆国，孙 艳，关永霞Δ，张贵民

（1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂276006；2.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006）

银黄口服液是以金银花和黄芩提取物为原料制成 的中药口服制剂，可用于治疗风热感冒所致咽干、咽痛、上呼吸道感染等证［1−3］，主要成分为黄酮类、挥发油、三萜皂苷类、无机元素、有机元素［4−5］。绿原酸为金银花提取物中最重要的有效成分，具有抗菌消炎作用，是银黄口服液质量控制的指标性成分［6］。绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸组成的酯类化合物，其分子结构中含有酯键、不饱和双键、多元酚羟基等不稳定化学键［7］，具有清热解毒作用，能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长增殖［8−9］。在银黄口服液的制备过程中，绿原酸往往会发生水解和异构化，导致含量显著下降。本研究中以2015年版《中国药典（一部）》中银黄口服液制备工艺为基础，优选了银黄口服液的制备工艺，并考察了制备过程中绿原酸含量的稳定性，以提高其绿原酸的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SENCOR501型旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）；Himac CR−GⅢ型系列高速离心机（天美科学仪器有限公司）；ME1002型电子天平（瑞士梅特勒−托利多有限公司，精度为十万分之一）；DRHH−S6型数显恒温水浴锅（上海双捷实验设备有限公司）。

1.2 试药

金银花（鲁南厚普制药有限公司，批号为20180602），经山东中医药大学李宝国副教授鉴定为忍冬科植物杀青干燥的花蕾；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111720−201708，纯度为98.7%）；新绿原酸对照品（批号为MUST−17100201，纯度为98.4%），隐绿原酸对照品（批号为MUST−18110603，纯度为98.6%），均购于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Aglient Zorbax SB−C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈−0.4%磷酸溶液（10∶90，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：327 nm；进样量：5µL。

2.1.2 溶液制备［10］

取绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸对照品各1.50 mg，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇适量，超声溶解并定容，得质量浓度为0.03 mg/mL的混合对照品溶液。

取黄芩提取物［按2015年版《中国药典（一部）》工艺制备］，加水适量使溶解，用8% NaOH溶液调pH至8.0，滤过，滤液与金银花提取物［按2015年版《中国药典（一部）》工艺制备］合并，用8% NaOH溶液调pH至7.2，煮沸60 min，滤过，加单糖浆适量，加入适量饮用水，混匀，用8%NaOH溶液调pH至7.2，加水至1 000 mL，滤过，灌封得100支。经100℃蒸汽灭菌30 min，即得样品（自拟批号为190725−2）。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：分别精密移取2.1.2项下混合对照品溶液1.0，2.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，混匀；吸取2.1.2项下样品溶液5 mL，加水定容至100 mL容量瓶中，经0.45µm微孔滤膜滤过。精密吸取上述溶液各5µL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，样品溶液色谱图中，有与混合对照品溶液对应的色谱峰出现。色谱图见图1。

1.新绿原酸2.绿原酸3.隐绿原酸A.混合对照品溶液B.样品溶液图1专属性试验高效液相色谱图1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenin acidA.Mixed reference solution B.Sample solutionFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

精密度试验：取同一批（批号为190725−2）样品，按2.1.1项下色谱条件于第1，2，3天分别测定6次，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸日内精密度保留时间的RSD分别为1.78%，1.92%，1.59%（n=6），峰面积的RSD分别为2.21%，1.82%，2.09%（n=6）；日间精密度保留时间的RSD分别为1.43%，1.84%，2.34%（n=6），峰面积的RSD分别为1.98%，2.56%，2.13%（n=6）。结果表明，仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为190725−2）样品，分别于4，8，12，16，20 h时进样测定。结果绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸保留时间的RSD分别为1.39%，2.43%，2.89%（n=5），峰面积的RSD分别为1.90%，2.18%，2.71%（n=5），表明样品溶液在20 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为190725−2）样品，按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸保留时间的RSD分别为2.89%，2.56%，2.19%（n=6），峰面积的RSD分别为2.32%，2.43%，2.71%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2 银黄口服液制备过程中绿原酸稳定性研究

2.2.1 金银花提取物制备中绿原酸含量变化

取金银花药材40.0 kg，按2.1.1项下色谱条件进样测定其绿原酸含量为3.0 %，均分为4批（分别编号为01，02，03，04），每批药材分别用10倍量和8倍量15%乙醇回流提取2次，合并提取液；减压浓缩至相对密度为1.16的浓缩液；用95%乙醇调节醇度至65%，静置24 h后用滤纸滤过，得醇沉液；加水至7.5 kg，得供配液。分别吸取上述提取液、浓缩液、醇沉液和供配液，按2.1.1项下色谱条件进样测定绿原酸的含量。详见图2。

图2 不同溶液绿原酸质量Fig.2 Quality of chlorogenic acid in different solutions

在金银花提取物制备过程中，绿原酸平均提取率为73.91%，浓缩液平均转移率为67.83%，绿原酸在提取和浓缩过程中较稳定。醇沉液中绿原酸的总量为药材的48.03%，与浓缩液相比，绿原酸损失率为29.20%，主要原因为沉淀中吸附大量绿原酸。供配液（编号为01）的绿原酸总含量高于醇沉液，可能原因为绿原酸向异构体的转化具有可逆性。

2.2.2 不同pH条件下煮药对绿原酸含量的影响

取黄芩提取物1.2 kg，按2015年版《中国药典（一部）》工艺，加水溶解，用8%NaOH溶液调pH至8.0，滤过，滤液备用；取样品（编号为01）适量，依法制备金银花提取物供配液5 kg，与上述滤液混合，均分为5份，分别用8% NaOH溶液调pH至5.6，6.0，6.5，7.0，7.2，煮沸1 h，分别测定其在调节pH前和煮药后的绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸含量变化。详见图3。可见，绿原酸和总绿原酸的含量随pH升高而降低，新绿原酸和隐绿原酸的含量随pH升高而升高，表明pH升高，有利于绿原酸转化为新绿原酸和隐绿原酸，且绿原酸的水解程度加大。调节pH至5.6时，黄芩提取物部分析出，黄芩苷稳定性好，pH对黄芩苷的含量影响较小，故煮药前调节药液pH至6.0。

图3 不同pH条件下煮药对绿原酸含量的影响Fig.3 Effect of decocting medicinal herbs at different pH on the chlorogenic acid content

2.2.3 不同煎煮时间对绿原酸含量的影响

取黄芩提取物1.8 kg，加水溶解，用8%NaOH溶液调pH至8.0，滤过，滤液备用；取样品（编号为02），依法制备金银花提取物供配液7.5 kg，与上述滤液混合，用8%NaOH溶液调pH至6.0，均分为5批，每批3份，分别煎煮30，45，60，75，90 min，测定绿原酸含量，并计算平均转移率。详见图4。可见，煮药时间为30 min和60 min时的绿原酸平均转移率相差3.98%，煮药时间为60 min和90 min时的绿原酸转移率相差1.87%，表明绿原酸转移率随着煎煮时间的延长而降低，即水解和异构化的速率降低，故煎煮时间确定为30 min。

图4 不同煎煮时间的绿原酸转移率变化Fig.4 Changes of chlorogenic acid content at different decoction time

2.2.4 不同灭菌方式对绿原酸含量的影响

取黄芩提取物1.8 kg，加水溶解，用8%NaOH溶液调pH至8.0，滤过，滤液备用；取样品（编号为03），依法制备金银花提取物供配液，与上述滤液混合，用8%NaOH溶液调pH至6.0，煎煮30 min，滤过，加单糖浆适量，加饮用水适量，搅匀，用8%NaOH溶液调pH至7.2，补水至6 000 mL，滤过，灌封得600支样品，均分为8份，采用0.1%苯甲酸钠+0.1%苯甲酸、80℃水浴60 min、100℃水浴30 min、100℃蒸汽30 min进行灭菌。灭菌后自然冷却，分别测定其绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸的含量。详见图5。可见，0.1%苯甲酸钠+0.1%苯甲酸灭菌后，绿原酸和新绿原酸平均转移率分别为96.23%和102.12%；100℃蒸汽灭菌30 min，绿原酸和新绿原酸平均转移率分别为85.21%和112.01%。结果表明，灭菌条件越剧烈，绿原酸转移率越低，新绿原酸转移率越高；不同灭菌方式下，总绿原酸和隐绿原酸转移率变化均较小，提示灭菌过程中绿原酸水解程度较轻，灭菌过程中绿原酸损失的主要原因为其异构化为新绿原酸。

a.0.1%苯甲酸钠+0.1%苯甲酸b.80℃水浴60 min c.100℃水浴30 min d.100℃蒸汽30 min图5不同灭菌方式对绿原酸转移率的影响a.0.1% Sodium benzoate+0.1% Benzoic acid B.80℃Water bath for 60 min C.100℃Water bath for 30 min D.100℃Steam for 30 minFig.5 Effect of different sterilization methods on the transfer rate of chlorogenic acid

2.3 稳定性试验

取2.2.4项下灭菌后的样品，于温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%环境下进行6个月加速试验，验证灭菌后样品的稳定性。结果见表1。可见，经0.1%苯甲酸钠+0.1%苯甲酸灭菌的样品在6个月加速试验后，其需氧菌总数超标；其他3种灭菌方式的需氧菌总数，霉菌、酵母菌总数，大肠埃希菌含量均符合检验标准。由图5可知，与其他2种灭菌方式相比，采用80℃水浴60 min方案灭菌，绿原酸转移率较高，水解和异构化程度均较轻，且灭菌后微生物限度检验合格，可更好保证灭菌后的药效。

表1 加速试验后不同灭菌方式微生物限度检查结果Tab.1 Microbial limit test results of different sterilization methods after the accelerated test

2.4 法定工艺与优化工艺绿原酸总转移率测定

取黄芩提取物1.8 kg，加水溶解，用8%NaOH溶液调pH至8.0，滤过，滤液备用；取样品（编号为04），依法制备金银花提取物供配液，与上述滤液混合，均分为法定工艺组和优化工艺组。优化工艺组采用优化工艺制备，均分为3份，每份分别用8% NaOH溶液调pH至6.0，煮沸30 min，滤过，加单糖浆适量，加饮用水适量，搅匀，用8% NaOH溶液调pH至7.2，补水至1 000 mL，滤过，灌封得100支样品，80℃水浴60 min灭菌；法定工艺组采用2015年版《中国药典（一部）》工艺制备，均分为3份，每份分别用8% NaOH溶液调pH至7.2，煮沸60 min，滤过，加单糖浆适量，加饮用水适量，搅匀，用8% NaOH溶液调pH至7.2，补水至1 000 mL，滤过，灌封得100支样品，100℃蒸汽灭菌30 min。分别测定每份药液调pH前和灭菌后的绿原酸含量。采用SPSS 24.0统计学软件分析，计数资料以率（%）表示，组间比较行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。详见图6。可见，与法定工艺组比较，优化工艺组总转移率提高了24.95%，差异显著（P<0.05），表明优化工艺能有效抑制绿原酸的水解和异构化，提高银黄口服液中绿原酸的含量。

图6 法定工艺与优化工艺条件下的绿原酸转移率（n=3）Fig.6 The transfer rate of chlorogenic acid under the statutory process and optimal process conditions（n=3）

3 讨论

在3批金银花提取物制备过程中，供配液（样品编号为01）的绿原酸总含量略高于醇沉液，可能原因为部分新绿原酸和隐绿原酸逆转化为绿原酸。在煎煮和灭菌阶段，由于pH和温度升高，绿原酸除部分水解外，主要被氧化为还原性较弱的新绿原酸和隐绿原酸。与煎煮和灭菌前相比，绿原酸和总绿原酸转移率均减少，新绿原酸和隐绿原酸转移率均升高。故在银黄口服液制备过程中，适当调低药液pH，减少煎煮时间，可有效减少绿原酸的氧化；而适量加入抗坏血酸、酒石酸、L−半胱氨酸等还原性药品添加剂，以抑制绿原酸氧化和水解，提高绿原酸含量的可行性有待进一步研究。

绿原酸具有广谱抑菌效果，能有效抑制细菌及部分真菌的生长繁殖，其抑菌活性明显优于新绿原酸和隐绿原酸［11−12］。在样品制备过程中，绿原酸损失的主要原因为异构化，次要原因为在碱性环境下易水解。由图3至图5可知，在弱酸条件下，绿原酸的异构化反应程度较小；减少煎煮时间、采用温和且有效的灭菌方式，可抑制绿原酸的异构化反应。本研究中通过优化制备工艺，在抑制绿原酸异构化的同时也有效抑制了其水解，与法定工艺相比，绿原酸总转移率提高24.95%，有利于提高银黄口服液抗菌、消炎的功效。