稻麦轮作体系下抗除草剂稻麦种质资源的挖掘与利用

朱鹏， 许轲， 凌溪铁， 王金彦， 杨郁文， 张保龙， 裘实*

（1.扬州大学，江苏省作物遗传生理重点实验室，农业农村部长江流域稻作技术创新中心，粮食作物现代产业技术协同创新中心，江苏 扬州 225009； 2.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，南京 210014）

水稻和小麦是全球最重要的两种粮食作物，在实现世界粮食安全方面发挥着重要作用。中国是全球稻麦种植和生产的大国之一，随着我国人民生活的改善，优质商品水稻和小麦的需求量呈现逐年递增的趋势，但可用于稻麦种植的劳动力却在逐年流失，成为我国农业发展的一大隐患。在我国稻麦轮作区，水稻传统的种植方式有人工插秧、机械化移栽和直播3种，通过移栽来种植水稻繁琐、耗时且成本很高，与移栽相比，直播的优点包括更快的生长速度、可避免移栽对植株的伤害、易于种植、更少的劳动力投入和水分需求以及品种早熟。城市化发展带来的农村劳动力流失使直播这一种植方式受到越来越多农业生产者的青睐；此外，由于过去几十年来直播技术的发展（如机械化播种机、机械除草机、改良除草剂），稻麦直播变得比移栽更受新型农业经营主体的青睐[1]。

当前，田间的草害问题越发严重，尤其在直播连作田杂草更是高发、频发。鸭舌草、稗草、千金子等是水稻田中的主要杂草种类，看麦娘、日本看麦娘、猪殃殃等是小麦田中常见的杂草种类[2]。田间的杂草与水稻植株争夺生长空间、水分、阳光和营养，增加病虫害的发生，释放有毒物质，抑制水稻的生长，对水稻的品质和产量都构成了极大的威胁。试验证明没有进行杂草管理的稻田一般减产5%～15%[3]，草害严重时减产可达15%～30%[4]。加之近几年水稻机械直播技术快速发展，秸秆还田工作加速推进，一定程度上加剧了草害对水稻生长的影响。杂草侵害是直播稻主要的生物学限制，对直播稻生产力的限制可达75%～80%[5]，直播稻易受杂草侵害归因于顽固的杂草植株群、干燥的种植条件、频繁的耕作、交替的干湿期以及苗龄在30～35 d的水稻幼苗竞争力弱于同期的杂草植株群[6]。田间杂草管理的方法主要分为物理除草和化学除草，在发展中国家，手工或使用机械进行除草更为普遍，而在发达地区和技术先进的地区，化学除草（喷施除草剂）占主导地位[7-8]。我国城市化的快速发展伴随着乡村劳动力的大量流失，导致田间劳动生产率下降、劳动成本上升，传统的人工除草方式已经无法适应我国农业的发展状况，化学除草是目前最经济有效的方法。合成除草剂的使用改变了传统的杂草管理，对全球作物的产量与质量作出了巨大的贡献，并产生了持续的创新。

然而抗性杂草的种类在逐年递增，这对田间杂草管理是非常严峻的考验。随着除草剂相关品种的研发进入瓶颈期，抗除草剂作物种质资源的发展与创制成为炙手可热的研究对象。将传统优势选择性除草剂通过合理复配，与对应抗除草剂稻麦种质资源配合使用，将高效地治理稻麦轮作区的顽固草害问题，特别对长期存在的恶性杂草和红稻具有不可替代的作用。抗除草剂作物如此受欢迎，归因于其可以搭配广谱的灭活型除草剂使用，使田间杂草管理更加低成本、简洁、灵活[9]。此外，抗除草剂作物还可以与免耕系统相结合，再次降低了田间作物的损伤风险。近年来，国内外学者针对抗除草剂作物的研究开展了广泛的工作，取得了一定的成果。本文对几类主要除草剂以及其相应的抗除草剂稻麦种质资源的研究进展进行综述，旨在为稻麦种药一体化栽培在直播稻中的应用提供理论依据。

1 除草剂使用现状

化学除草剂的使用已成为稻麦轮作区防除杂草最主要的手段，2010年就全球销售额而言，水稻田除草剂占水稻田农药的43.2%，为16.47亿美元[10]。在我国，水稻田中化学除草剂的用量约占农药产品总用量的15%，这一比例在发达国家中所占份额更高，而且我国对化学除草剂的需求量仍在逐年递增[11]。根据功能分类，除草剂可以分为灭生型和选择型两大类，灭生型除草剂指对田间所有绿色植物都具有生物活性的除草剂，在一定用量下对田间的作物和杂草都会造成伤害，如草甘膦、草铵膦等；选择型除草剂指具有较强针对性的除草剂，在一定用量下仅对田间某种或某类杂草造成伤害而不会伤害作物，如麦草畏、吡氟禾草灵等。随着全球除草剂的广泛使用，一系列与除草剂相关的问题也接踵而至，如环境污染、抗性杂草等问题对全球生态环境的建设产生了严重的影响。抗性杂草是全球农业发展的绊脚石，农户在田间盲目地使用单一除草剂导致田间杂草产生了耐药性，目前已有报道多种恶性杂草对不同种类的除草剂具有抗性，如黑麦草属、苋属和稗属杂草等[12]。据我国有关部门报道，已经有37种杂草的59个生物型被检测出对化学除草剂产生了一定的抗药性，其所对应的化学除草剂共计10类31种[13]。

传统创制抗除草剂作物的方法主要有3种，一是在种质资源库中筛选并加以利用；二是通过诱变技术获得突变群体，在一定的选择压下筛选天然突变体，以获得抗性植株；三是通过转基因方法创制对除草剂有抗性的新品种，将可以对除草剂产生抗性的抗性基因导入受体有2种最常用的方法，分别是农杆菌介导转化法和基因枪介导转化法[14]。过去的20年对作物进行基因改造的趋势在不断增加，作物中引入的主要转基因性状为抗除草剂、抗虫、抗病毒和抗逆境，其中，抗除草剂作物占转基因作物的近83%[15]。抗除草剂作物，尤其是转基因抗除草剂作物在国际上被快速的采用，相关的农场管理实践表明，它们已经成为管理杂草的重要工具。抗除草剂作物在一定程度上改变了杂草的管理方法，对全球农业的发展作出了卓越的贡献。

2 除草剂主要类型及作用机制

2.1 草甘膦与草铵膦

草甘膦和草铵膦同属于氨基酸类非选择性除草剂，这2种除草剂皆为芽后除草剂。

2.1.1 草甘膦 草甘膦[glyphosate,化学名N-(膦酰基甲基)甘氨酸，化学式：C3H8NO5P]是广谱有机磷除草剂之一,它是一种在农业中广泛使用的除草剂，可防治多年生和1年生杂草。草甘膦是非选择性和芽后除草剂的重要成分，用于保护作物免受禾本科植物、1年生阔叶杂草、木本植物等的侵害[16]。1974年，草甘膦除草剂的母体化合物由孟山都公司以商品名“Roundup”进行出售[17]。草甘膦属于C-P键膦酸盐类的有机磷除草剂，是磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）的类似物，可抑制5-烯醇丙酮基莽草酸3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS），这是合成芳香族氨基酸的关键酶[18]（图1）。因为这种机制只在植物、细菌、真菌和顶端复合体寄生虫中发现，所以草甘膦对各种杂草具有高度活性，但是对哺乳类动物的影响不大[20]。草甘膦是广谱、高效、低毒、廉价的内吸传导型除草剂，其被植株的茎叶吸收后传导到植株的地下部，对深根杂草的地下组织破坏力强，一般农业机械也很难达到其可达到的破坏深度。因为其在土壤中会迅速降解，故被认为是污染最小、安全性最强的商品化除草剂之一。虽然草甘膦除草剂的优点明显，但其对于水稻的生理毒性致使其很少直接应用于水稻生产中，因此耐草甘膦水稻的发展将大大降低生产成本，促进水稻种植业的发展。

图1 草甘膦与EPSPS底物结合位点结合、抑制其活性［19］Fig. 1 Glyphosate binding to EPSPS substrate binding sites and inhibiting its activity［19］

2.1.2 草铵膦 由于草甘膦抗性杂草数量和种类的增加，需要不同作用模式的除草剂来保护作物的产量。草铵膦（glufosinate）是一种从绿色产色链霉菌中分离出的非选择性氨同化抑制剂，它可以对谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）产生抑制作用[21]。GS是用于将氨结合到谷氨酰胺中的必需酶，谷氨酸在GS的作用下添加氨而形成谷氨酰胺，因此草铵膦的抑制作用会导致氨的过量积累。光合作用的第二种抑制是氨基酸的消耗，这是GS抑制的下游效应，这种作用可能是草铵膦除草活性的主要原因；由于GS抑制导致的氨基酸消耗，导致光呼吸途径中乙醇酸途径（乙醇酸途径介导乙醇酸的氧化以产生乙醛酸，最终产生氨基酸甘氨酸）的氨基（NH2）供体消耗，从而阻止了乙醛酸向甘氨酸的转化。研究表明，乙醛酸通过阻止RuBP的激活来抑制光合作用，RuBP是参与光和二氧化碳固定的关键酶[22-23]。抑制光合作用会导致膜损伤、叶绿素漂白，最终导致组织坏死。

2.2 乙酰乳酸合成酶抑制类除草剂

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）是合成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸的关键酶[24]，通过对ALS的酶活性进行抑制能够对支链氨基酸的合成产生阻碍作用，蛋白质的合成也会因此受到影响，从而抑制植物的生长[25]，因此，ALS是重要的除草剂靶点。ALS抑制类的除草剂根据其分子结构可分为5个家族，包括磺酰脲类除草剂（sulfonylureas，SU）、咪唑啉酮类除草剂（imidazolinones，IMI）、嘧啶水杨酸类除草剂（pyrimidyl-benzoates, PB）、磺酰氨羧基三唑啉酮类除草剂（sulfonlyaminocarbonyl-triazolinones，SCT）和三唑并嘧啶磺酰胺类除草剂（triazolopyrimidine，TP）[26]。ALS抑制剂类除草剂是对底物进行阻断作用，阻断其进入酶的活性位点，从而影响二者之间的结合，进而对支链氨基酸的生物合成产生抑制作用，对生物体内的蛋白代谢活动产生破坏，最终达到灭杀杂草的目的[27]。乙酰乳酸合成酶主要存在于高等植物及真菌和细菌中，目前还未在动物体内发现ALS的存在，因此使用ALS抑制类除草剂可以在保证对植物有高度伤害的前提下降低对动物的毒性，减轻了对动物的伤害[28]。由于ALS抑制类除草剂的高强活性、杀草谱广、选择性强、使用方便等特点，使得ALS抑制类除草剂自问世来，销量就稳居前列，成为仅次于草甘膦的除草剂系列，也是最受欢迎的选择型除草剂系列，近几年ALS抑制类除草剂的销量依旧呈持续增长的态势。

2.3 原卟啉原氧化酶抑制类除草剂

原卟啉原IX氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, PPO）是有效的除草剂靶点之一，PPO催化原卟啉原IX氧化为原卟啉IX，原卟啉IX是四吡咯合成系统的最后一种常见中间体，普遍存在于所有血红素和叶绿素合成生物中[29]。在用PPO除草剂处理后，易感植物由于PPO的抑制而积累原卟啉原IX。原卟啉原IX被转运到细胞质，与非特异性质膜结合的过氧化物酶反应自发形成原卟啉IX。原卟啉IX在细胞质中积累，并在有光的情况下产生单线态氧，导致脂质过氧化，即它会导致细胞膜降解和细胞裂解，最终造成植株死亡[30]。现有的几种PPO类抑制剂除草剂包括二苯醚、噻二唑、恶二唑、三唑啉酮等，均可抑制原卟啉原IX氧化酶。在1980—1990年间，PPO抑制类除草剂被广泛使用。然而，在20世纪90年代中期引入抗草甘膦作物后，PPO抑制类除草剂的销量开始下降；这种状况一直持续到2006年，国内外出现了越来越多对草甘膦具有抗性作用的杂草；杂草对ALS类抑制剂、草甘膦的广泛抗性使得国内外农业生产者恢复了PPO类抑制剂除草剂的大量使用[31-32]。

2.4 对羟苯基丙酮酸双氧化酶抑制除草剂

对羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-hroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD）除草剂是一种相对较新的除草剂，因其广泛的杂草防治谱、低施用率、作物选择性和低毒性而在全球范围内得到广泛应用[33]。HPPD是生育酚和质体醌（plastoquinone, PQ）生物合成的关键酶，HPPD在植物体内催化对羟苯基丙酮酸（4-hroxyphenylpyruvate, HPP）产生尿黑酸，尿黑酸是PQ与生育酚生物合成中的关键前体物质，HPPD抑制类除草剂的抑制机制是与HPP基质的竞争性作用，即使酶与抑制剂紧密结合，从而影响尿黑酸的产生；生育酚是一种抗氧化剂保护膜[34]，PQ不仅是光合作用中的电子转运体，还是类胡萝卜素生物合成中的辅助因子[35]。当HPPD被抑制时，生育酚和PQ水平下降，导致类胡萝卜素耗尽，致使叶片漂白和植物死亡，HPPD抑制剂对植物的损伤程度取决于类胡萝卜素的转换量，因此较老组织的损伤速度比幼嫩组织慢。生育酚与类胡萝卜素可以作为活性氧的清除剂在健康的植株中发挥作用，植物组织因此受到保护从而免受伤害[36]。许多HPPD抑制类的除草剂在全球范围内被引入，不同种类的HPPD抑制剂类除草剂结构差异较大，但是对HPPD的活性都有专一的抑制性，三酮类（硝磺草酮，mesotrione；环磺酮，tembotrione）、异噁唑类（异噁唑草酮，isoxaflutole）和吡唑类（苯吡唑草酮，topramezone）等是目前市场上主要的对HPPD具有抑制作用的除草剂化合物[37]。

2.5 乙酰辅酶A羧化酶抑制除草剂

乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制除草剂于1978年随着双氯氟草胺的出现首次引入市场[38]。这类除草剂可选择性地控制双子叶作物杂草，也可以在一定限度内对单子叶作物产生活性影响，估计每年处理面积为1.2亿hm2[39]，在对抗草甘膦杂草的管控中起到了至关重要的作用。ACCase是一种催化丙二酰辅酶A形成的重要酶，反应产物丙二酰辅酶A参与质体中脂肪酸的生物合成以及长链脂肪酸和次级代谢产物的延伸，这些代谢产物对能量储存、细胞或细胞器的生物膜结构组成和激素调节至关重要[40]。针对ACCase的除草剂可以抑制禾草植物的叶绿体ACCase活性，导致脂肪酸产量下降，这类除草剂通常在出苗后用于控制稻麦田中的杂草[41]。ACCase由生物素-羧基载体蛋白（biotin carboxyl-carrier, BCC）、生物素羧化 酶（biotin carboxylase, BC）和 羧 基 转 移 酶（carboxyltrans-ferase, CT，具有亚基α和β）3个功能域组成，BC和CT结构域承担依赖于ATP、Mg2+和HCO3-的催化活性，这导致乙酰辅酶A羧化和丙二酰辅酶A的形成。下面是由BC和CT亚基催化的2个反应[42-43]。

已在植物中鉴定出2种不同类型的ACCase，即胞液型和质体型。质体型对ACC类抑制剂敏感，在草类中酶活性高达80%[44]。抑制ACC活性的除草剂是近年来除草剂品种发展过程中较为重要的除草剂，其种类主要包括芳氧苯氧丙酸类（aryloxyphenoxypropionate，AOPP）与环己烯酮类（cyclohexanedione， CHD）化合物，主要产品有禾草 灵 (diclofop)、精 恶 唑 禾 草 灵 (fenoxaprop-P-ethyl)、喹 禾 灵 (quizafop-ethyl)、噻 唑 禾 草 灵(fenthiaprop)、稀 禾 定 (sethoxydim)、烯 草 酮(clethodim)等，它们通过抑制质体型乙酰辅酶A羧化酶的活性使得脂类生物的合成受到阻碍，最终造成植物死亡。

2.6 激素类除草剂

在大量、多种除草剂的使用中，激素类除草剂的作用不容忽视。激素类除草剂的结构与生长素吲哚乙酸（indolyl-3-acetic acid，IAA）相似，对植株体内的激素平衡具有一定的影响，根据生长素的双重性，二者皆在低水平使用时对植株具有生长促进作用，高水平时杀死植株[45]。第二次世界大战后，生长素除草剂2,4-D和MCPA进入全球市场，开启了现代农业杂草控制的新时代，目前，这类除草剂常见的种类包括苯氧羧酸、苯甲酸、吡啶羧酸、芳香羧甲基衍生物和喹啉羧酸[46]。激素类除草剂问世后，对田间一年生与多年生阔叶类杂草的防治作出了很大贡献。

3 转基因抗除草剂稻麦种质资源创制

转基因抗除草剂作物是利用基因工程技术从某种生物体中提取所需的抗除草剂基因，将其转入目标农作物中，使其与目标农作物的基因进行重组，从而培育出对特定除草剂产生优良抗性的新种质。从1995—2014年，转基因作物的种植使化学农药的施用量降低了37%，作物产量提高了22%，使农民的利润提高了68%[47]。转基因抗除草剂作物在1996年首次实现了商业化，自此以后，抗除草剂性状便一直是转基因作物研究的主要性状，2019年转基因抗除草剂作物的全球种植面积约8 000万hm2，占全球转基因作物种植面积的88%左右[48]。中国在转基因技术研发方面投入了大量资源，取得了一定进展，我国已获得具有营养改善、抗旱、抗药、耐盐碱、营养高效利用等重要性状的基因300多个，并且已筛选出46个具有自主知识产权和重要育种价值的功能基因[47]。在抗除草剂基因方面，我国共有48项专利，发掘的抗除草剂基因可以使作物分别对草甘膦、草铵膦、咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂产生不同程度的抗性，其中抗草甘膦的基因就达到40项[49]。由于转基因技术快速发展，其优势越来越明显，主要体现在提高除草效果、降低除草成本；利于采用保护性耕作；有助于采用窄行间距种植。

3.1 抗草甘膦与草铵膦稻麦种质资源

草甘膦在植物体内会与EPSPS和三磷酸莾草酸（S3P）结合形成复合体，这将导致EPSPS的活性受到抑制，生物体正常的氨基酸代谢也因此受到阻碍，从而使植物死亡[50]。EPSPS是广泛存在于植物、微生物中参与莽草酸代谢途径的重要酶，是草甘膦的作用靶点，天然状态下对草甘膦比较敏感，转基因作物对草甘膦的解除机制是通过过量表达EPSP酶，EPSP酶与草甘膦竞争性结合，从而达到增强植株抗性的目的。农杆菌（Agrobacteriumsp.）中有一种CP4酶，是细菌中的EPSPS，其对草甘膦不敏感。CP4对PEP具有很高的亲和力，转基因作物通过异源表达CP4基因，使得莽草酸途径可以在不经过作物自身的EPSPS体系的情况下正常进行。Chhapekar等[51]在这一理论基础下，通过将密码子优化的CP4 EPSPS转入到水稻品种IR64中，得到了可以对10倍商业推荐使用剂量的草甘膦具有耐受作用的转化植株。soil EPSPS是王云鹏等[52]在2014年成功克隆的1个新的抗草甘膦的EPSPS基因，利用农杆菌浸染的方法，使soil EPSPS在水稻中异源表达，获得了1种全新的转基因抗草甘膦植株，经过测试，这种抗性植株能够对高达500 mmol·L-1的草甘膦产生耐受作用。2015年，浙江大学研究人员利用农杆菌介导法将密码子优化的杀虫基因HJC-1和细菌克隆而来的抗草甘膦EPSPS基因G6导入栽培水稻品种‘秀水110’中，成功培育出具有抗虫、耐草甘膦双重功效的转基因水稻“G6H1”[53]。2018年，董玉凤等[54]成功将表达G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因转入水稻，获得抗草甘膦转基因水稻G2-6、G2-7，与非转基因品种‘中花11’相比，其草甘膦抗性分别提高了104和123倍，并且该品种很大程度上降低了转基因漂流的概率。

抗草铵膦作物的抗性源自2种使草铵膦失活的乙酰转移酶同源酶基因中的1种，分别是绿色产色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）的膦丝菌素乙酰转移酶基因（phosphinothricin acetyltransferase gene，PAT）、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的双丙氨磷抗性基因（bialaphos resistance gene,BAR)[55],它通过催化草铵膦氨基的乙酰化可以使草铵膦失活，应用转基因技术表达该类基因，是获得耐除草剂转基因农作物的一种方法。目前，已成功将Bar基因导入到一系列作物中，如油菜、玉米、甜菜、大豆、亚麻、豌豆、水稻、小麦、烟草、番茄、黑麦、马铃薯、大麦及胡萝卜等[56]。研究人员通过将Bar基因转入‘秀水 04’‘D68’‘明恢 63’‘E32’‘R187’‘R893’等两系或者三系恢复系水稻品种以及‘旱稻297’和‘旱稻502’中[57]，培育出多个具有应用价值的抗草铵膦转基因水稻新材料。Wang等[58]通过农杆菌介导法将Bar基因转入到北方粳型恢复系‘津稻162’和‘津稻18’中，并利用0.25%的草铵膦除草剂Basta对T0代转基因植株分别进行涂布试验，检测出转基因的‘津稻162’的抗性植株率为92%，‘津稻18’的抗性植株率为78%。Zhu等[44]利用基因枪法将Bar基因导入到水稻品种‘京引119’中，并开展了利用Bar基因提高和快速鉴定杂交稻纯度的尝试[59]，同时还成功将抗草甘膦基因cp4转入水稻，配制出抗草甘膦和草铵膦的转基因直播稻品系（组合）嘉禾98及杂交稻组合辽优1046等，为直播稻的化学除草技术做出了杰出贡献[50]。秦冠男等[60]发现来自细菌Nocardiasp. AB2253 的蛋氨酸砜 N-乙酰基转移酶基 因（methionine sulfone nacetyltransferase gene,Mat）编码产物具有N-乙酰基转移酶活性，能解除草铵膦的毒性，但这种基因在植物中表达效率较低，于是用水稻偏爱密码子优化的Mat#基因转化籼稻品系9K，除草剂抗性检测结果显示，该转化体的芽期草铵膦耐受剂量至少为 600 mg·L-1、秧苗期草铵膦耐受剂量至少为 1 000 mg·L-1，对草铵膦的抗性水平不低于转Bar的水稻‘9KA2’。

3.2 抗ALS类除草剂稻麦种质资源

Li等[61]从拟南芥抗磺酰脲类除草剂突变系GH50中分离出1种突变的乙酰乳酸合成酶基因csrl-1，这种突变体的乙酰乳酸合成酶基因与磺酰脲类除草剂亲和力很低，已将其导入水稻中，此基因在在转基因水稻细胞中受启动基因CaMV35S控制，使转基因水稻对氯磺隆的抗性提高了200倍。Kawai等[62]研究证明水稻来源的ALS中W548L/S627I位点突变的基因可以作为筛选标记基因，得到抗除草剂双草醚（bispyribac-sodium，BS）的转基因水稻。

3.3 抗PPO类除草剂稻麦种质资源

研究发现利用转基因的方法在水稻中过量表达 人 类（Homo sapiens）、枯 草 杆 菌（Bacillus subtilis）、粘球菌（Myxococcus xanhus）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的protox基因，能够获得水稻新品系，这些新品系对PPO类抑制型除草剂能产生一定的耐药性[40]。Lee等[63]发现，来自枯草杆菌的原卟啉原氧化酶对二苯醚除草剂具有耐性，于是将其导入水稻中，它在水稻植株细胞质或质体中的表达导致了转基因水稻对乙氧氟草醚（oxyfluorfen）的高度抗性。Jung等[64]研究发现导入了在叶绿体与线粒体表达粘球菌的原卟啉原氧化酶的转基因水稻品种M44对乙氧氟草醚的抗性提高200倍以上。

3.4 抗HPPD类除草剂稻麦种质资源

据报道，目前已经有多个能够对HPPD抑制类除草剂产生抗性的HPPD基因被克隆表达，例如从Coptis japonica克隆了CjHPPD基因，在植株中过量表达CjHPPD基因可以使植株对吡唑特和双环磺草酮产生耐受性[65]；从土壤宏基因组克隆表达了能够使植株抗磺草酮的mHPPD基因[66]；黄彦等[67]克隆了菌株Pseudomonassp. AM-H4的HPPD基因，检测发现将此基因在植株体内过量表达可以使植株对HPPD抑制类除草剂产生抗性。目前，对于抗HPPD抑制类除草剂作物的研究仍在继续，但还没有相关转基因稻麦种质资源商业化应用的报道。

3.5 抗ACC类除草剂稻麦种质资源

山西农业大学的高爱保等[68]通过对小麦的近缘品种谷子对ACC类抑制剂除草剂的抗性研究发现，小麦ACC酶1779I-1779Leu会导致其对APP类和CHD类除草剂产生抗性，加速了对抗ACC类除草剂稻麦种质资源商品化研究的进展。

3.6 抗激素类除草剂稻麦种质资源

麦草畏是目前市场上激素类除草剂中较受欢迎的一种，属苯甲酸类，前人从土壤细菌Pseudonanas maltophilia(菌系DI-6)中分离出能降解麦草畏的酶DMO，DMO在双子叶植物中的表达可以使植株抵抗致死量麦草畏所带来的影响，目前利用转基因技术将该基因在大豆、烟草、番茄中进行了过量表达，突变株皆对麦草畏产生了一定的耐受性，但是有关其在稻麦种质资源中的作用还在研究中[69]。

4 非转基因抗除草剂稻麦种质资源创制

随着转基因技术的发展，非转基因这一定义也开始被提出，非转基因技术指含有少于0.9%的转基因原理的育种技术，其在抗除草剂稻麦种质资源的创制过程中起到了先导作用。随着生物技术与基因工程的发展，非转基因技术也不只是单纯的传统育种，传统育种与生物技术的结合使得抗除草剂作物种质资源的开发迅速发展[70]。目前选育抗除草剂作物的非转基因方法多种多样，主要有传统杂交育种、种子诱变、花粉选择、细胞（原生质体）融合和细胞组织培养，利用这些方法选育出了众多抗除草剂作物并得到推广应用，其中也不乏优质的稻麦种质资源。现如今，基因编辑技术CRISP/Cas9也是一大热门非转基因育种技术，其不仅易操作、效率高，还可以定向改造抗除草剂基因，为农作物的种质资源创制提供了一条全新的道路。

4.1 抗草甘膦稻麦种质资源

草甘膦作为国内销量最高的除草剂，对其具有抗性的种质资源是一大研究热门。魏松红等[71]应用紫外线和叠氯化钠对小麦种子进行诱变，成功获得抗草甘膦的小麦植株。童汉华等[50]对‘中花11’‘京引119’等粳稻品种种子进行γ射线辐射诱变处理，通过对诱变体在秧苗期分别施以不同水平草甘膦，逐步聚合对草甘膦的抗性，从‘中花11’的辐射后代中成功选育出1份耐草甘膦突变体材料，该突变体材料能耐20 mL·L-1的草甘膦。Li等[72]使用CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）通路对水稻EPSPS基因的Thr102Ile和Pro106Ser碱基进行定点置换，并用含有Thr102Ile和Pro106Ser的相同DNA片段对水稻EPSPS基因片段进行定点置换突变，成功获得了抗草甘膦的水稻材料，并且替换位点和插入突变位点稳定地遗传给下一代。

4.2 抗ALS类除草剂稻麦种质资源

到目前为止，使用非转基因方法培育出的抗除草剂种质资源最成功的即为抗ALS类除草剂作物种质资源。2007年Endo等[73]发现，利用基因靶向编辑技术将ALS基因序列中的第548位氨基酸处的色氨酸（TGG）转变为亮氨酸（TTG），以及将第627位氨基酸处的丝氨酸（AGT）转变为异亮氨酸（ATT），可以有效提高植株对双草醚的抗性。2012年，深圳市兴旺生物种业有限公司使用EMS诱变技术对‘黄华占’和‘黄丝占’2个品种进行诱变，利用0.345%的咪唑啉酮类除草剂灭草烟对其3～4叶期的幼苗进行喷施，随后进行筛选，最终存活的植株即为具有抗性的植株，对具有抗性的‘黄华占’和‘黄丝占’品种进行测序的结果表明，‘黄丝占’的突变植株是由于ALS基因发生了Ala96Val或Trp548Cys或Ser627Asn突变，‘黄华占’的突变株是由于ALS基因发生了Ala96Thr或Trp548Met突变，导致原本对咪唑啉酮类除草剂不具抗性的植株产生了抗性[74]。夏兰琴等[75]在2015年对‘日本晴’品种使用CRISPR/Cas9技术定点修饰了ALS第548、627位的氨基酸（TGG-TTG、AGT-ATT），实现了利用基因工程方法对水稻ALS基因的定点突变，成功获得了抗嘧啶羧酸类除草剂双草醚的水稻植株。张保龙等[76]在2021年利用EMS技术对‘籼稻93-11’品种种子进行了诱变，随后使用咪唑啉酮类除草剂甲基咪草烟（又名百垄通）对3～4叶期的M2植株进行喷施，最终筛选出对百垄通具有抗性的水稻突变植株；对抗性突变株进行测序发现，突变抗体的ALS基因序列中第627位丝氨酸不仅突变为天冬氨酸，还会突变为亮氨酸，2种突变都会使‘籼稻93-11’产生对除草据百垄通的抗性。2018年，江苏省农业科学院粮食作物研究所历经多年，在7 403份水稻品种资源材料里筛选出具有抗咪草烟特性的‘金梗 818’[77]。

4.3 抗ACC类除草剂稻麦种质资源

随着对ACC抑制类除草剂研究的不断深入，已经培育出多种抗ACC抑制类除草剂作物种质资源，通过非转基因技术组织培养筛选获得具稀禾定（sethoxydim）抗性的墨西哥甜玉米B50S品系，还有通过传统育种培育出抗ACC类除草剂的高粱，二者皆已实现商业化[78]。Liu等[79]基于ACCase CT结构域序列设计sgRNA，构建了3个突变文库eABE、eBE3和eCDA，在eABE和eBE3文库中发现了对高效盖草能具有抗性的Ile1879Val、Trp2125Ser和Cys2186Arg突变体。Li等[80]结合胞嘧啶编辑器A3A-PBE和腺嘌呤碱基编辑器PABE-7构建了1个STEMEs系统（饱和靶向内源性诱变编辑器），使用STEMEs编辑水稻ACCase基因，获得了具有Ser1866Phe、Ala1884Pro、Pro1927 Phe和Trp2125Cys替换的突变体，其中，Pro1927 Phe和Trp2125Cys突变体对除草剂盖草能的抗性足够高，可用于田间杂草防治。维多利亚农业服务有限公司使用叠氮化钠和甲基亚硝基脲对水稻种子进行诱变，获得了对精喹禾灵具有抗性的突变体，该突变体在ACCase的羧基转移酶编码区有1个G到A的突变，导致Gly2096Ser突变和对ACC类抑制剂除草剂的抗性[81]。第1个获批的水稻PVL01来自BASF 1-5，BASF 1-5是抗ACC类抑制剂除草剂的水稻品系，在ACCase蛋白中发生了Ile1781Leu突变[82]。这对田间除草系统是一项非常好的补充，种植者可以交替使用ALS类抑制剂除草剂和ACC类抑制剂除草剂来控制田间杂草。

5 结语

水稻和小麦是我国最重要的粮食作物，稻麦轮作是我国南方传统耕作方式，探索在推动直播连作背景下加快稻麦抗除草剂种质资源的挖掘与利用，构建稻麦抗除草剂材料种药一体化生产模式具有重大的现实意义。无论是利用转基因技术还是非转基因技术培育出的抗性作物，都是抗除草剂作物种质资源研究和应用领域的重大突破，在扩大除草剂的使用范围、延长使用时间、降低除草成本、减少耕作、降低能耗等方面发挥了重要作用。随着抗除草剂作物的广泛种植，在很大程度上改变了杂草防治的方式，但是随着除草剂的反复使用，杂草对除草剂的抗性也在逐渐增强，这就需要尽快开发新作用机制除草剂及其抗性作物技术，为加快建设绿色有机稻麦产业提供坚实的技术支撑。