慢病毒介导的ADAM8基因沉默对胃癌MKN45细胞EMT、侵袭和迁移的影响

阿继鹏 李德元 曹贵章

(青海省交通医院普外科，青海 西宁 810001)

胃癌5年总生存率低，侵袭和转移是其手术、放疗和化疗失败的主要原因〔1～6〕。更好地了解肿瘤发生和癌细胞转移对于胃癌患者的诊断标志物和新型有效疗法的开发是必不可少的。解整合素和金属蛋白酶(ADAM)8基因是ADAM蛋白酶家族的成员，具有蛋白水解酶活性，参与机体炎症反应过程〔7〕。ADAM8在多种肿瘤中表达上调，如胶质瘤、肺腺癌、前列腺癌和乳腺癌等，在肿瘤的发病及进展中起积极作用〔8～10〕。研究显示，ADAM8在胃癌组织中呈高表达，且与胃癌的淋巴结转移、肿瘤大小、临床分期等病理特征密切相关，提示ADAM8的高表达可能与胃癌的侵袭和转移有关〔11〕。然而关于ADAM8对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)、侵袭和迁移的研究目前鲜有报道。因此本实验通过慢病毒介导的ADAM8基因沉默探究ADAM8对胃癌MKN45细胞EMT、侵袭和迁移的影响，以期为胃癌的靶向治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞株和主要试剂 人胃癌细胞株MKN45由中国科学院上海细胞资源中心提供；RPMI1640培养基由美国Invitrogen公司提供；胰蛋白酶、胎牛血清由美国Gibco公司提供；Real-time反转录试剂盒由日本TaKaRa公司提供；Trizol试剂、Real-time PCR检测试剂盒由美国Promega公司提供；细胞裂解液、电化学发光(ECL)检测试剂盒由美国Thermo公司提供；十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)配制试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒由上海碧云天生物技术研究所提供；ADAM8 shRNA慢病毒载体构建及包装由上海吉凯基因化学技术有限公司完成；Transwell小室由美国Millipore公司提供；基质胶由美国BD公司提供；ADAM8、E-钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和N-cadherin单抗及辣根过氧化物酶标记的二抗均由美国CST公司提供。

1.2细胞培养 人胃癌MKN45细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，放置在体积分数5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中常规培养。用显微镜观察MKN45细胞状况，待细胞贴壁生长密度达90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化MKN45细胞，按照1∶3的比例进行传代。

1.3MKN45细胞的慢病毒转染 对数期的胃癌MKN45细胞用胰酶消化，以1×105/孔接种于6孔板中，放置到37℃培养箱过夜培养，待细胞生长融合率达50%左右时进行慢病毒转染，其中感染复数(MOI)=20(参照预实验结果)，将ADAM8 shRNA慢病毒载体转染MKN45细胞记为实验组(sh-ADAM8组)，将慢病毒空载体转染MKN45细胞记为阴性对照组(sh-NC组)，未行转染处理的MKN45细胞记为空白对照组(Blank组)。转染后各组MKN45细胞继续培养72 h，收集细胞进行相关指标检测。

1.4Real-time PCR检测 收集转染72 h各组MKN45细胞，采用Trizol法抽提细胞总RNA，使用Nanodrop超微量核酸检测仪测定RNA的纯度和浓度。使用Real-time反转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，18s RNA为内参，每组设置3个复孔，采用Real-time PCR检测试剂盒行Real-time PCR检测。ADAM8引物：上游引物5′-CGATGATGCTGCCTGCGATTG-3′；下游引物5′-CGCAGGTGGAGGGTGAAGTT-3′。18s RNA引物：上游引物5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′；下游引物5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。反应程序设为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。待反应结束后，获取内参基因和目的基因的Ct值，采用相对定量2-ΔΔCt法分析各组MKN45细胞中ADAM8 mRNA的表达水平。

1.5Western印迹检测 收集转染72 h各组MKN45细胞，加入适量细胞裂解液，于冰上裂解细胞30 min提取总蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白定量，在蛋白中加入3倍的上样缓冲液，沸水加入5 min。配制SDS-PAGE凝胶，每个泳道孔加入30 μg蛋白样品，行凝胶电泳，蛋白分离后转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，于50 g/L脱脂奶粉中封闭2 h，洗涤膜后加入相应一抗，ADAM8一抗为1∶800稀释，E-cadherin、Vimentin和N-cadherin一抗为1∶600稀释，4℃孵育过夜，洗涤膜后再加入1∶2 000稀释的二抗，室温孵育1.5 h，洗涤膜后滴加ECL显色液，显影，曝光，以GAPDH进行标定，用Image J软件分析各组MKN45细胞中目的蛋白表达水平。

1.6Transwell实验 基质胶融化，用不含血清的培养液稀释，加入Transwell小室的上室进行包被，晾干备用。收集转染72 h后的各组MKN45细胞，加入不含血清的培养液悬浮细胞，调整细胞密度至1×105/ml。取200 μl细胞悬液加入基质胶包被的Transwell小室的上室，下室添加600 μl含10%胎牛血清的培养液，在37℃培养箱继续培养24 h。取出小室，用棉签擦去未穿过基底膜的细胞，甲醇固定后结晶紫染色，于显微镜下观察各组MKN45细胞侵袭细胞数。

1.7划痕实验 转染后各组MKN45细胞培养至对数生长期，以胰酶消化收集细胞，加入培养液重悬细胞，接种到34孔板中，放置在37℃培养箱常规培养，待细胞呈单层融合时，使用灭菌的枪头在细胞中进行划痕，PBS洗去划下的细胞，更换培养液，放置在37℃培养箱继续培养72 h，在倒置显微镜下观察细胞划痕宽度，分别计算各组MKN45细胞迁移率，细胞迁移率(%)=迁移距离/初始划痕距离×100%。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1构建稳定沉默ADAM8基因的MKN45细胞株 与sh-NC组相比，sh-ADAM8组MKN45细胞中ADAM8 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，与Blank组相比，sh-NC组中ADAM8 mRNA和蛋白表达水平无明显改变(P>0.05)。见图1、表1。提示稳定沉默ADAM8基因的MKN45细胞株构建成功。

图1 Western印迹检测MKN45细胞中ADAM8蛋白的表达

表1 各组MKN45细胞中ADAM8 mRNA和蛋白表达比较

2.2沉默ADAM8基因阻碍MKN45细胞EMT的发生 与sh-NC组相比，sh-ADAM8组MKN45细胞中E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.05)，Vimentin和N-cadherin蛋白表达明显下调(P<0.05)，与Blank组相比，sh-NC组中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表达无明显改变(P>0.05)。见图2、表2。表明沉默ADAM8基因能够抑制MKN45细胞EMT过程。

表2 各组MKN45细胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表达比较

图2 Western印迹检测E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表达

2.3沉默ADAM8基因抑制MKN45细胞侵袭能力 与sh-NC组相比，sh-ADAM8组侵袭细胞数明显减少(P<0.05)，与Blank组相比，sh-NC组侵袭细胞数无明显改变(P>0.05)。见表3。表明沉默ADAM8基因能够抑制MKN45细胞侵袭能力。

2.4沉默ADAM8基因抑制MKN45细胞迁移能力 与sh-NC组相比，sh-ADAM8组细胞迁移率明显降低(P<0.05)，与Blank组相比，sh-NC组细胞迁移率无明显改变(P>0.05)。见表3。表明沉默ADAM8基因能够抑制MKN45细胞迁移能力。

表3 各组MKN45细胞侵袭细胞数、细胞迁移率比较

3 讨 论

ADAM8基因位于人类染色体10q26.3上，其编码的蛋白质由824个氨基酸组成。ADAM8蛋白既具有蛋白水解酶的功能，可参与降解细胞外基质；又具有去整合素的功能，可参与调节细胞形态和运动〔12〕。研究表明，ADAM8作为促癌基因在肺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌等多种恶性肿瘤组织和细胞中异常高表达，并且ADAM8的过量表达与肿瘤转移相关〔13，14〕。刘光耀等〔15〕研究显示，ADAM8在胃癌细胞株中的表达显著高于正常细胞，提示ADAM8可能参与胃癌的发生和发展。但ADAM8在胃癌细胞中的研究目前尚未见报道。

本实验采用慢病毒转染技术，将ADAM8 shRNA转染至胃癌MKN45细胞，分别在基因和蛋白水平上验证了成功构建稳定沉默ADAM8的MKN45细胞。随后Transwell实验和划痕实验结果显示，沉默ADAM8的MKN45细胞侵袭和迁移能力均明显降低。EMT是具有极性的上皮细胞向具有活动能力的间充质细胞转化的过程。研究显示，EMT与肿瘤的浸润和转移密切相关，EMT的发生为肿瘤转移的发生提供先决条件〔16〕。本实验结果提示沉默ADAM8能够抑制EMT的发生，进而影响细胞侵袭和转移能力。本实验结果与以往关于ADAM8调节肿瘤细胞侵袭和转移的研究相符，如胡以利等〔17〕研究显示，ADAM8的表达异常升高能够正向调控胃癌细胞的增殖活性和侵袭能力。如Conrad等〔18〕研究指出，ADAM8通过上调MMP-9和跨内皮迁移来促进乳腺癌MB-231细胞转移。

综上，沉默ADAM8可通过逆转EMT抑制MKN45细胞的侵袭和迁移。提示ADAM8基因可能作为胃癌靶向治疗的新靶点，为进一步探究ADAM8与肿瘤侵袭和转移的关系提供新的实验依据。然而，ADAM8在胃癌中是如何影响胃癌细胞侵袭和迁移，其具体作用机制尚需进一步探究。