地黄饮片至标准汤剂物质传递研究

万莹莹，杜微波，陈敬然，张志强，沈建梅

(北京康仁堂药业有限公司，中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101301)

地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的块根，性寒，味甘，归心、肝、肾经，具有清热凉血、养阴生津等功效[1]。环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类成分是地黄主要活性成分及发挥疗效的物质基础[2-4]，其极性普遍较大，易溶于水，受煎煮时间及温度影响，含量变化显著[5-7]。且鲜地黄中不含异毛蕊花糖苷，通过一定温度及时间的加工炮制后，产生毛蕊花糖苷向异毛蕊花糖苷转化的现象[8-9]。近年来，对地黄HPLC指纹图谱建立的研究多有报道[10-11]，为地黄的质量评价提供了一定参考。中药饮片标准汤剂是饮片以中医药理论和临床应用作为依据，以水为提取溶剂，经标准化工艺制备而成。中药配方颗粒以标准汤剂作为其发挥药效作用的基准物质，是保证与传统中医临床质量疗效一致性的关键，因此，对其进行物质成分分析尤为重要。但以现有研究基础不能全面分析饮片-标准汤剂物质传递情况，阐明标准汤剂的物质分布。目前也未见地黄饮片-标准汤剂物质传递过程分析。随着技术的发展，已有学者将超高效液相色谱(UPLC)技术应用于中药指纹图谱研究中[12]，UPLC具有快速高效、灵敏度高、准确度高等优点，有较好的应用前景。本研究拟建立能够反映地黄饮片-标准汤剂质量的UPLC特征图谱，并利用液质对9个特征峰进行结构推断，结合新的公式-K值，分析地黄饮片-标准汤剂物质变化情况，明确传递规律，阐释地黄标准汤剂物质分布，为科学、合理地筛选地黄标准汤剂质量控制指标成分提供依据。

1 仪器及试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC©H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent Extend C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱(美国Agilent公司)；Agilent 6530 Q-TOF高分辨飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)；KQ-300DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LGJ-50FD真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

1.2 试药及试剂

毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院，批号：111530-201512，纯度：96.7%)；地黄(生地黄)(中国食品药品检定研究院，批号：121180-201506)；乙腈、甲酸为色谱纯均购于Fisher Chemical；水为屈臣氏蒸馏水；15批地黄标准汤剂样品，均由北京康仁堂制药有限公司制备。标准汤剂样品信息见表1。

表1 材料来源

2 方法与结果

2.1 地黄标准汤剂制备

按2020版《中国药典》地黄饮片炮制的规定进行炮制，获得地黄饮片。取饮片于砂锅中，浸泡30 min，一煎加入饮片量9倍水，武火(500 W)煮沸后，文火煎煮20 min，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量7倍水，武火煮沸后，文火(200 W)煎煮15 min，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液，浓缩(50 ℃以下)，浓缩至料液比约为1∶1(密度为1.05～1.10 g/mL(50 ℃))，冷冻干燥，即得。

2.2 特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；以乙腈(含0.1%甲酸)为流动相A，以0.1%甲酸为流动相B，按表2中的规定进行洗脱；检测波长为334 nm；柱温45 ℃；流速0.45 mL/min；进样体积5 μL；理论塔板数按毛蕊花糖苷峰计算应均不低于5 000。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.2.2 参照物溶液制备 取地黄(生地黄)对照药材，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含毛蕊花糖苷3 μg的溶液，摇匀，作为对照品参照物溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察 ① 重复性试验：按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份，记录其特征图谱，以毛蕊花糖苷为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积。相对保留时间RSD为0.02%～0.11%，相对峰面积RSD为1.16%～4.96%，表明该方法重复性良好。② 中间精密度试验：采用不同仪器按照“2.2.3”项下方法获得6份供试品溶液的特征图谱，以毛蕊花糖苷为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积。相对保留时间RSD为0.14%～1.22%，相对峰面积RSD为1.27%～5.66%；不同仪器间相对保留时间RSD为0.01%～0.18%，相对峰面积RSD为1.31%～17.75%，表明在不同仪器间该特征图谱的相对保留时间符合分析要求，但相对峰面积差异较大。③ 稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h进样测定，记录色谱图，并以毛蕊花糖苷为参照物峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积，相对保留时间RSD为0.04%～0.35%，相对峰面积RSD为2.24%～5.43%，表明供试品溶液在24 h内测定结果稳定。

2.2.5 特征峰的推断与确认 按照“2.2”项下方法制备15批标准汤剂供试品溶液并测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，以1号为参照图谱，按中位数计算，进行共有峰标识，生成对照图谱，并确定峰3为毛蕊花糖苷，见图1。利用高效液相串联高分辨飞行时间质谱仪对9个特征峰进行结构推断，确定了7个特征峰的分子式，并参考地黄化学成分相关文献，推断了6个特征峰，其中峰1、7、8为环烯醚萜苷类，峰2、3、4、5为苯乙醇苷类成分，推断结果见下表3，化合物结构见图2。

图2 特征峰化学结构

表3 质谱成分推测结果

图1 地黄标准汤剂对照特征图谱

2.3 饮片至标准汤剂物质传递分析

按照“2.2”项下“特征图谱的建立”方法获得15批饮片的特征图谱数据，以9个特征峰峰面积、样品浓度及出膏率计算K值，分析饮片至标准汤剂物质传递情况，结果见表4。

K=标准汤剂特征峰面积×饮片浓度×出膏率饮片特征峰面积×标准汤剂浓度

由表4可知，15批地黄饮片与标准汤剂各峰都进行了物质传递，除峰4、9外，其余各峰K值<1，均在0.12～0.68范围内，表明传递趋势相同且效率相近；峰4、9中均有多个批次K值>1，表明传递过程中可能存在物质转化，从而成分得到有效富集，但受产地因素影响较大。

表4 饮片至标准汤剂K值

3 讨论

地黄标准汤剂作为中药饮片的水煎液，物质基础主要为水溶性成分，其中环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类为主要活性物质，水溶性好，但对热敏感，饮片-标准汤剂煎煮过程存在成分的损失和转化，且物质传递规律及分布无法监控。因此针对标准汤剂中主要活性物质，利用UPLC建立了真实反映标准汤剂物质传递规律及分布的特征图谱，该方法精密度和稳定性良好。

目前特征图谱多采用相似度、特征峰相对保留时间及特征峰数目等评价方式，均属于定性评价，不适用于物质传递规律的总结。指标成分转移率以成分含量的相对值进行定量评价，能够表明物质成分的变化趋势，但仅适用于有对照品参照的成分。因此针对标准汤剂中该类成分，依据指标成分转移率公式，建立基于特征图谱分析物质传递规律的新公式-K值，以峰面积进行比对，在缺少成分对照品的前提下也能够进行分析，同时降低了多因子对于结果分析的影响，能够科学地分析饮片-标准汤剂物质传递规律。

通过K值分析，地黄饮片-标准汤剂过程中9个特征峰均进行了传递，除峰4、9外，其余各峰K值均<1。有研究表明，环烯醚萜苷类成分在不同炮制品中含量有显著差异，结合的糖越多，分解速度越慢[7]，由特征峰化学结构可知，地黄标准汤剂中成分多含双糖结构，表明结合二糖的环烯醚萜苷在汤剂中较为稳定，能够实现其有效的转移；而峰4中有9个批次K值>1，地黄标准汤剂中同时含有毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷，根据文献[9]报道,毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷在一定条件下可以相互转化，其峰4的K值>1可能与毛蕊花糖苷在煎煮过程中动态转化为异毛蕊花糖苷有关；峰9未推断出化学结构，但其K>1，表明有其他成分向其转化。由此可知，地黄标准汤剂中上述成分传递规律符合环烯醚萜苷类及苯乙醇苷类成分的特性，表明K值能够辅助分析饮片-标准汤剂的物质传递情况，利用该传递规律可更好地指导中药配方颗粒的生产和控制。

本研究利用地黄标准汤剂专属性UPLC特征图谱方法，结合新的评价公式-K值，能够表明饮片-标准汤剂物质变化规律，明确地黄标准汤剂的物质分布，指导标准汤剂质量控制指标的合理筛选，为后续以标准汤剂为基准的配方颗粒或经典方制剂质量控制提供依据，也为其他品种饮片-标准汤剂物质传递分析提供借鉴。