外源褪黑素对鸡胚发育的影响研究

王 宜，张玉清，吴子薇，方 婷，杜志强，杨彩侠

（长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025）

相对于哺乳动物，鸡具有独特的生物学特性。鸡ZW 雌性胚胎性腺发育为不对称的卵巢，右侧的卵巢分化形成后在后续孵化期间逐步退化，只保留左侧卵巢继续发育，PGC 位于左侧卵巢的皮质区。反之，ZZ 同型配子的性腺发育为双侧对称的睾丸。鸡为卵生，胚胎发育主要在体外，便于操作，易于获得，因此，是研究胚胎生物学和发育生物学的理想动物模型[1]。

褪黑激素（N- 乙酰-5- 甲氧基色胺，Melatonin）是一种内源性胺类神经内分泌激素，主要在脊椎动物松果体中，由前体物质色氨酸经芳香氨基酸脱羧酶等的作用衍化生成，几乎存在于所有生物体内。在鸡胚孵化中，松果腺的发育始于孵化约60小时，胚胎第7 天出现可分辨的松果腺细胞[2]，胚胎第10 天可测量到内源褪黑素[3]，胚胎第13 天后，开始有节律地合成内源褪黑素[4]。褪黑素和5- 羟色胺可在禽蛋中形成一个弥散的神经内分泌系统，调节胚胎的发育和代谢事件[5]。褪黑素参与多种生理功能，除了调控生物节律和发育代谢外，还影响生殖、肿瘤和衰老等[6]。在啮齿类动物上，褪黑素降低雌性大鼠卵巢重量[7],降低雄性仓鼠睾丸重量[8]。在鸡胚上，褪黑素信号影响眼和心脏的形态发生[9]，也拯救低氧诱导的心血管发育异常[10]。然而，外源褪黑素对鸡胚孵化和器官发育的效应缺乏研究。

本研究旨在通过向孵化2.5 天的鸡胚卵黄囊内注射外源褪黑素，评价褪黑素对鸡胚孵化、生殖器官发育和重要内脏器官及肌肉发育的影响效应，为进一步深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料获得、分组、开孔注射和孵化

540 个AA 肉鸡种蛋购自汤阴县全达家禽育种有限公司。种蛋消毒、称重（53±2g），分成6 组（正常对照、开孔、0.9%生理盐水、0.17 μmol/L、1.7 μmol/L、17 μmol/L 褪黑素），每组9 个重复，每个重复10 个，编号后放入孵化箱（科裕微电脑全自动孵化机）中孵化。孵化程序如下：1～7 天，温度参数37.9℃，湿度参数50%；8～14 天，温度参数37.8℃，湿度参数55%；15～17 天，温度参数37.5℃，湿度参数65%；18 天之后，温度参数37.2℃，湿度参数70%；孵化全程风机开启，灯开启。

孵化2.5 天，正常对照组继续孵化，其他五组经照蛋确定卵黄囊位置，75%酒精消毒后用迷你小电钻在气室端开直径0.5 mm 的圆孔（图1），开口组不做注射，直接封口膜封口继续孵化，其他四组用1 mL 注射器垂直向下分别注射10 μL 的生理盐水，0.17 μmol/L、1.7 μmol/L、17 μmol/L 的褪黑素进入卵黄囊[9]，注射完毕后封口膜封口继续孵化，注射操作半小时完成。

图1 种蛋开孔位置及大小

1.2 主要试剂

主要试剂有：褪黑素（货号M5250，Sigma），Trizol（货号15596026，Thermo），RevertAidFirstStrandcDNA SynthesisKit（货号K1622，Thermo），ChamQUniversal SYBRqPCRMasterMix（货号Q711-02，诺唯赞）。

1.3 检测指标

分别于孵化第5 天、第9 天和孵化第13 天照蛋并剔除没受精的蛋，并称量活胚的蛋重。孵化第17 天称量活胚的蛋重。从孵化第19.5 天开始每半天统计每组出雏雏鸡个数并称量出雏雏鸡重量，直到22 天孵化结束。分别统计每组的出壳鸡个数、未出雏个数、出雏雏鸡性别。从每组出雏仔鸡中随机选取10 个，分离并测量卵巢或睾丸长度，称量心、肝、脾、胰腺、胸肌、腿肌等重量。

1.4 RT- qPCR 检测雏鸡卵巢抗氧化基因

从0.9%生理盐水、1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素组出雏雏鸡中随机选取3 个，分离左侧卵巢，快速冻存于-80℃。Trizol 提取雏鸡卵巢总RNA，检测RNA 质量和浓度，1μg RNA 反转为cDNA。将cDNA 模板稀释6 倍，用于荧光定量PCR 扩增，反应体系为10 μL。设计鸡Sod1、Sod2 和Cat 的特异引物（表1），送至上海生工生物工程有限公司合成，无酶水稀释引物至100 μmol/L，-20℃保存。10 μL反应体系：5 μL 的2x ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix，3.6 μL 水，1 μL cDNA，0.4 μL 10 μmol/L上下游引物。PCR 反应条件为：95℃10min；95℃15 秒，60℃60 秒，40 循环。每个样品设3 个技术重复孔。Gapdh 作为内参基因，2-ΔΔCt方法计算表达量的变化。

表1 RT-qPCR 引物信息

1.5 统计分析

采用SPSS 25 软件对数据进行统计分析，其中百分比数据，如孵化率、死亡率、性别比例采用卡方检验分析，其他数据均用单因素方差的LSD 分析。试验数据以均值±标准误表示。P＜0.05 时指示差异显著。

2 结果与分析

2.1 种蛋开孔对鸡胚孵化的影响

种蛋开孔组（气室端，直径0.5 mm 的圆孔）的雏鸡孵化率（60.38%） 与未开孔的正常对照组（79.43%）相比显著降低（P＜0.05），而种蛋开孔组的种蛋孵化死亡率（39.62%）比正常对照组（20.57%）显著增加（P＜0.01）（表2）。但是，对于各胚龄活胚蛋重（第5、7、13 和17 天）和雏鸡出雏重，开孔组和正常对照组无显著差异（P＞0.05）。开孔组的雄雏比为50.40%，雌雏比为49.60%，而正常对照组雄雏比为55.92%，雌雏比为44.08%，两组之间没有显著的差异（P＞0.05）（表2）。对于雏鸡的出雏时间，开孔组和正常对照组相比也没有明显差别（P＞0.05）（表3）。对于雏鸡生殖器官长度和内脏器官重量，开孔组与正常对照组相比，卵巢长度、左侧睾丸长度、右侧睾丸长度、心脏重、肝脏重、胰脏重、胸肌重、左腿肌重、右腿肌重均无显著差异（P＞0.05）,但种蛋开孔孵化的雏鸡脾脏重量显著高于对照组（P＜0.05，表4）。综合这些数据表明，种蛋孵化2.5 天气室端开直径0.5mm 的圆孔会显著升高后期孵化胚胎的死亡率，降低种蛋的孵化率，增加出雏雏鸡脾脏重量而影响鸡胚的发育。

表2 种蛋开口对孵化的影响

表3 开孔对雏鸡出雏时间的影响

表4 种蛋开孔对雏鸡生殖和内脏器官发育的影响 （单位：cm、g）

2.2 褪黑素对鸡胚孵化和发育的效应

注射0.17 μmol/L、1.7 μmol/L 和17 μmol/L 外源褪黑素组的孵化率分别为51.04%、61.01%和49.14%，相比生理盐水注射对照组孵化率（48.92%），1.7 μmol/L 褪黑素组孵化率提高12.09%，但各组没有达到统计显著水平（P＞0.05，表5）。同样，对胚胎死亡率、孵化期的胚蛋重/雏鸡出雏重和雏鸡的性别比例在褪黑素处理组和生理盐水对照组之间也没有显著差异（P＞0.05，表5）。而对于雏鸡出雏时间，0.17 μmol/L 褪黑素组与0.9%生理盐水对照组相比没有显著变化（P＞0.05），1.7 μmol/L 褪黑素组相对对照组出雏时间显著推后0.5 到1 天（P＜0.01），17 μmol/L 褪黑素组相对对照组出雏时间显著推后1～1.5 天（P＜0.001，表6）。这些数据表明，孵化2.5天气室端开孔注射1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素10 μL 会显著推迟雏鸡出雏时间。

表5 褪黑素对鸡胚孵化的影响

表6 褪黑素对雏鸡出雏时间的影响

对于雏鸡生殖器官长度和内脏器官重量，0.17 μmol/L、1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素组与生理盐水注射对照组相比，卵巢长度、左侧睾丸长度、右侧睾丸长度、心脏重、肝脏重、脾脏重、胸肌重、左腿肌重、右腿肌重均无显著差异（P＞0.05，表7）, 但17 μmol/L 褪黑素组的雏鸡胰脏重量显著低于生理盐水对照组（P＜0.05，表7）。综合这些数据表明，种蛋孵化2.5 天气室端开孔注射1.7 μmol/L和17 μmol/L褪黑素会显著推迟雏鸡出雏时间，注射17 μmol/L 褪黑素显著降低出雏雏鸡胰脏重量。

表7 褪黑素对雏鸡生殖和内脏器官发育的影响 （单位：cm、g）

2.3 褪黑素对雏鸡卵巢氧化应激基因表达的影响

RT-qPCR 检测结果显示注射1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素对21 胚龄的鸡胚卵巢氧化应激相关基因Sod1、Sod2、Cat 表达无显著影响（P＞0.05，表8）。

表8 褪黑素对雏鸡卵巢氧化应激基因表达的的影响

3 讨论

由于体外孵化发育给研究处理带来了便利性，所以鸡胚是理想的发育生物学研究模型。种蛋导入外源物质多采用胚蛋开窗注射技术[11]。研究表明白莱航家鸡种蛋开窗的位置、大小和封口方式等都对孵化率和鸡胚发育有不同程度的效应[11]。相对于正常白莱航家鸡的平均出壳率85.0%，气室端开窗大幅度降低平均出壳率到61.0%[11]。本研究结果显示AA 肉鸡种蛋正常组孵化率为79.43%，而气室端开0.5 mm 直径的圆孔会显著降低孵化率到60.38%，与报道结果一致[11]。在不影响注射操作的情况下，种蛋开孔越小对鸡胚造成的机械损伤越少[12]。本研究采取在孵化2.5 天种蛋的气室端开0.5 mm 直径圆孔以尽量降低对种蛋的损伤，但是开孔组鸡胚的死亡率（39.62%） 依然显著高于正常对照组（20.57%），表明蛋壳的完整性对鸡胚的孵化是十分重要的。本研究还发现，开孔组出雏雏鸡脾脏的重量显著高于正常没开孔组，证实了种蛋开孔对鸡胚器官发育的影响。文献报道种蛋孵化率随注射入种蛋中液体的体积增加而明显下降，因此，在剂量不影响试验结果的情况下应尽可能地减少注射带入鸡胚的外源液体体积[12]。本研究注射10 μL 生理盐水组的孵化率是48.92%，低于开孔不注射组的60.38%，表明针刺内壳膜注射入胚胎10 μL 液体依然会损伤胚胎，降低孵化率。

褪黑素参与调控生物节律、发育、代谢、生殖、肿瘤和衰老等[6]。最近研究发现褪黑素具有抗新冠病毒（Covid-19）的效应[13]。补充褪黑素可以拯救低氧诱导的心血管发育异常[10]、然而，补充外源褪黑素对鸡胚孵化和器官发育的效应缺乏研究。本研究结果表明，与生理盐水对照组相比，在孵化2.5 天注射10 μL 1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素显著推迟出雏时间，而且推迟雏鸡出雏时间与浓度成正比，这是否与褪黑素调控鸡内部发育生物钟信号有关尚需验证。有报道表明，孵化2 天的鸡胚补充外源褪黑素影响鸡胚心脏成型和视杯的形成[9],而孵化17 天的鸡胚补充外源的褪黑素会影响周期性的心脏功能[14]。本研究结果并没发现孵化2.5 天注射不同浓度的外源褪黑素影响雏鸡心脏的重量，但注射17 μmol/L 褪黑素显著降低雏鸡胰脏的重量。胰腺可以外分泌包含各种消化酶等的胰液，可以消化糖、蛋白质和脂肪；胰腺也可以内分泌胰岛素、胰高血糖素等，进而调节血糖以维持机体的正常活动。因此，在本研究中17 μmol/L 褪黑素诱导的胰腺重量降低可能影响胰脏的分泌功能，从而影响雏鸡后续的代谢和生长。以前的研究也表明，高浓度褪黑素激活胰腺癌细胞系的线粒体凋亡通路，而低浓度褪黑素阻止凋亡[15]。褪黑素与生殖息息相关，文献报道褪黑素影响雌性大鼠卵巢重量[7]和雄性仓鼠睾丸重量[8]。但是，褪黑素与鸡胚的生殖器官发育联系缺乏研究。本研究结果显示孵化2.5 天鸡胚注射不同浓度的褪黑素对出雏雏鸡的卵巢和睾丸长度没有显著影响，卵巢和睾丸重量由于太小而无法准确称量。进一步利用RT-qPCR检测雏鸡左侧卵巢的氧化应激基因表达（Sod1、Sod2、Cat）,结果显示孵化2.5 天鸡胚注射1.7 μmol/L和17 μmol/L 褪黑素不影响这三个基因的mRNA 表达水平。已知褪黑素具有抗氧化功能，能够改善体外培养的氧化应激诱导功能损伤的仔鸡卵巢[16]。本研究中褪黑素与生殖器官的发育和氧化应激基因表达没有影响可能与褪黑素的浓度、注射时间和检测时间有关系，尚待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明：（1）种蛋开口显著降低雏鸡孵化率, 提高鸡胚死亡率和增加雏鸡脾脏重;（2）注射1.7 μmol/L 或17 μmol/L 褪黑素显著延迟雏鸡出雏时间；（3）注射17 μmol/L 褪黑素显著降低雏鸡胰脏重。研究结果为利用褪黑素改善肉鸡孵化性能提供了参考。