6-BA对濒危植物大花黄牡丹不定芽增殖的影响

姚霞珍，桑利群，徐 慧，李 双，陈丽仙

（西藏农牧学院资源与环境学院，西藏 林芝 860000）

大花黄牡丹（Paeonia ludlowii）属毛茛科芍药属落叶灌木，是西藏特有濒危植物［1］，生于海拔2 900～3 200 m 的雅鲁藏布江河谷及山坡林缘。其植株高大，黄色花朵硕大，是珍贵的观赏、育种材料，属于国家二级保护植物，喜温和气候、较耐寒，抗旱能力较弱［2，3］。大花黄牡丹自然繁殖方法为种子繁殖［4-6］，存在繁殖速度慢、苗木品质弱、种苗数量缺乏等问题，大花黄牡丹的快速繁殖成为急需解决的问题。利用组培快速繁殖的方法培育优良品种苗，可以不受地区、气候的影响，且增殖速度比常规方法更快［7］，能够高效、快速地获得大花黄牡丹种苗，加速大花黄牡丹优良品种的繁育。该研究分析了基本培养基、植物生长调节剂6-BA 对大花黄牡丹不定芽诱导增殖的影响，以期为今后的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外植体的选择是植物组织培养的关键，外植体选择合适与否直接影响消毒、无菌体系建立以及整个组培流程的难易程度［7，8］。采集时间为2020年9月下旬、2021年3月中旬，采集地点为西藏自治区林芝市西藏珍稀濒危园林植物培育基地，在晴天午间选取健壮、无病虫害的高约1～2 m 的大花黄牡丹母株，切取其饱满、未萌发的腋芽及顶芽。

1.2 启动培养

1.2.1 启动培养基 培养基作为植物组织培养的重要材料和营养来源，其组成成分直接影响外植体的脱分化与再分化状态，是起决定性作用的因素［7，8］。本次试验选用2 种培养基进行对比分析。

培养基1：WPM+0.5 mg/L 6-BA+30.2 mg/L GA+30.0 g/L 蔗糖+7.5 g/L 琼脂，pH 为5.8～6.0。

培养基2：WPM（含20.0 g/L 蔗糖+8.0 g/L 琼脂）+0.5 mg/L 6-BA+30.2 mg/L GA，pH 为5.8～6.0。

将培养基置于灭菌锅，120 ℃灭菌20 min，然后转至超净工作台等待外植体接种。

1.2.2 外植体清洗及消毒 挑选健壮饱满大花黄牡丹的顶芽和腋芽，剥除外部2～3层鳞片，将剥好的芽于自来水下冲洗30 min，洗涤剂浸泡8～10 min，流水冲洗30 min。将清洗干净的芽转到超净工作台，用75%的乙醇浸泡灭菌20～30 s，再用2%的次氯酸钠浸泡灭菌7 min，重复2次，最后，无菌去离子水冲洗4～5遍［9］。

1.2.3 启动培养接种 将剩余芽体接种于启动培养基，每瓶接种1 个外植体，每组接种15 瓶，重复3 次，培养35～40 d。

1.3 增殖培养

在启动培养优选出的培养基中分别添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 的6-BA，筛选适宜大花黄牡丹继代苗增殖的最佳生长调节剂浓度。

在无菌条件下取初代芽，分别接入不同的培养基中，每组处理20 瓶，重复3 次。接种后每隔10 d 观察生长情况，第35 d 时取出，在无菌条件下统计株高、叶片数及增殖率。

1.4 培养条件

在组织培养过程中，光照、温度、培养基pH 是诱导木本植物器官发生的重要因素［7，8］。光照对组织褐变、试管苗成熟以及玻璃化均有显著影响，温度与酚类化合物合成以及组培苗生根有关［10，11］。该试验的培养温度为25 ℃，光照度32.4 mol/（m2·s），光周期为14 h 光照、10 h 黑暗，培养基pH 为5.8～6.0，以上所有试验均在西藏农牧学院第二实验楼进行。

1.5 数据处理

用Excel 2016 软件对数据进行统计，SPSS Statistics 26 软件方差分析，邓肯氏新复极差法进行多重比较（P＜0.05）。

不定芽增殖率=（再生不定芽的外植体数/接种外植体数）×100%

2 结果与分析

2.1 优选培养基

在启动培养试验中观察得出的数据中，WPM+30.0 g/L 蔗糖+7.5 g/L 琼脂+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA 更有利于不定芽生长。

在启动培养的基础上，将产生的不定芽接种到不定芽增殖分化培养基上，10 d 后可以观察到基部有不定芽产生，17 d 后单芽基部产生的不定芽生长明显。

2.2 不同浓度6-BA 对大花黄牡丹试管苗生长的影响

2.2.1 对试管苗株高的影响 不同浓度6-BA 对试管苗株高的影响见图1，5 个6-BA 处理组的株高均显著高于对照（CK），在6 个组中，6-BA 为0.5 mg/L时，试管苗平均株高最高，显著高于其他处理组合；CK 组的试管苗平均株高最低。因此，添加浓度为0.5 mg/L 6-BA 时最有利于试管苗长高。

图1 不同浓度6-BA 对试管苗平均株高的影响

2.2.2 对试管苗叶片平均数的影响 不同浓度6-BA 对试管苗叶片平均数的影响见图2，在6 个处理组中，6-BA 为0.5 mg/L 时，试管苗叶片平均数最多，显著多于其他处理组合；CK 组的试管苗叶片平均数最低。因此，6-BA 浓度为0.5 mg/L 时最有利于试管苗叶片的生长，其他浓度的6-BA 相对较弱，CK 组表现效果最弱。

图2 不同浓度6-BA 对试管苗叶片平均数的影响

2.2.3 对试管苗增殖率的影响 不同浓度6-BA 对试管苗增殖率的影响见图3，5 个6-BA 处理组培苗苗增殖率均显著高于CK 组，在6 个处理组中，6-BA浓度为0.5 mg/L 时试管苗增殖率最高，显著高于其他处理组合；CK 组的试管苗增殖率最低。因此，6-BA 浓度为0.5 mg/L 时最有利于试管苗的增殖，而CK 组对试管苗增殖的影响最小。

图3 不同浓度6-BA 对试管苗增殖率的影响

2.2.4 对试管苗生长质量的影响 从表1、图4 可知，6-BA 浓度为0.4、0.5 mg/L 时，大花黄牡丹试管苗芽的质量等级最高，但因D 处理的玻璃化等级高于E 处理，因此，6-BA 为0.5 mg/L 时最适宜试管苗的生长；而CK 组和A 处理的芽质量等级均最低，但因CK组的玻璃化等级高于A 处理，所以未添加6-BA 的培养基最不利于试管苗的生长。

图4 不同浓度6-BA 中试管苗增殖和生长的状况

表1 不同浓度6-BA 对试管苗增殖和生长的影响

3 小结与讨论

从大花黄牡丹不定芽的增殖和生长状况来看，添加了植物生长调节剂6-BA 的培养基明显更有利于组培苗的生长。虽然培养基的成分和植物生长调节剂的种类等都会对不定芽的获取产生一定的影响，但起决定作用的主要是植物生长调节剂［9］。细胞分裂素的主要作用是促进植物细胞分裂与扩大，从而使愈伤组织分化形成不定芽，所以适量的细胞分裂素可以促进组织分化，提高芽增殖倍数［12，13］。

在组织培养中通常使用人工合成的性能稳定且价格适中的KT 和6-BA，而在许多木本花卉及热带观叶花卉的组培生产中，使用6-BA 均较KT 效果更好［12-14］，所以本试验选择了6-BA 作为促进植物细胞分裂与扩大以及诱导愈伤组织形成不定芽的植物生长调节物质，并通过单因素浓度梯度对比获取适宜大花黄牡丹不定芽增殖的生长调节剂浓度，为今后多因素对比试验提供一定的参考。