优势腐败菌对暗纹东方鲀冷藏期间品质变化影响及致腐能力分析

冯豪杰，蓝蔚青,2,3,*，臧一宇，唐书文，刘大勇，徐 逍，周大鹏，谢 晶,2,3,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306；4.江苏中洋生态鱼类股份有限公司，江苏 南通 226600）

暗纹东方鲀（Takifugu obscurus），又名河鲀，为鲀科东方鲀属，是淡海水洄游鱼类，主要分布在我国近海和长江中下游。其肉质鲜嫩，脂肪与蛋白质含量丰富，深受广大消费者喜爱[1]。2019年我国河鲀鱼的淡水养殖产量达9 911 t[2]，市场需求量逐年递增。

冷藏是水产品的常用保鲜方法，但部分微生物在低温下仍能快速生长，导致水产品发生腐败变质[2]。尽管鱼类最初的微生物群由大量微生物组成，但在其货架期结束时，只有少数微生物群占主导地位，称其为优势腐败菌[3]。优势腐败菌能产生大量腐败代谢产物，通过分解蛋白质和脂肪产生异味，腐败活性强。相关研究发现，新鲜鱼在冷藏条件下的优势腐败菌主要为假单胞菌属（Pseudomonasspp.）、希瓦氏菌属（Shewanellaspp.）与气单胞菌属（Aeromonasspp.）等[4]。腐败希瓦氏菌（S.putrefaciens）为革兰氏阴性好氧菌，具有较强的蛋白质分解和产生硫化氢、三甲胺、生物胺等胺类化合物的能力[5]。李萌等[6]研究发现荧光假单胞菌（P.fluorescens）是导致冷藏河鲀鱼片腐败变质的主要腐败菌。在冷藏及有氧条件下，荧光假单胞菌会产生蛋白酶、脂酶等，生成令人不快的异味，具有较强的生物被膜形成能力[7]。此外，Zhang Caili等[8]研究发现，将气单胞菌和假单胞菌联合接种会加速草鱼的腐败过程，促进生物膜形成；Wang Hang等[9]将气单胞菌、假单胞菌与腐败希瓦氏菌分别接种到冷藏草鱼上，发现气单胞菌与假单胞菌会引起挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、生物胺含量快速增长，而腐败希瓦氏菌会产生更多的挥发性化合物。然而，关于暗纹东方鲀优势腐败菌对其品质变化影响与致腐能力分析鲜见研究。

基于此，本课题组前期从贮藏末期暗纹东方鲀中分离出P.fluorescens和S.putrefaciens，并将其以单一和联合法接种至暗纹东方鲀，通过测定微生物（菌落总数、假单胞菌数、希瓦氏菌数）、理化（pH值、TVB-N含量、K值、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力）、蛋白质（总巯基含量、肌原纤维碎片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）、内源荧光强度（intrinsic fluorescence intensity，IFI））等指标，结合核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），并通过腐败代谢产物产量因子评价，综合表征两种优势腐败菌对冷藏暗纹东方鲀品质变化及致腐能力影响。本研究有助于进一步探究鱼类优势腐败菌的致腐机制，为开发暗纹东方鲀的新型靶向保鲜技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

P.fluorescens与S.putrefaciens均为本课题组前期研究分离所得，现保藏于课题组实验室。

暗纹东方鲀，体质量（450±50）g，体长（20.0±1.5）cm，购自江苏中洋生态鱼类股份有限公司，置于泡沫箱增氧保持鲜活状态，1 h内运至实验室。

平板计数琼脂、假单胞菌CFC选择性培养基、胰酪胨大豆肉汤培养基（trypticase soy broth，TSB）、铁琼脂青岛海博生物技术有限公司；氧化镁、硼酸 国药集团化学试剂有限公司；巯基含量测试盒、黄嘌呤氧化酶测试盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 仪器与设备

Kjeltec2300型凯氏定氮仪 瑞士FOSS公司；e2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司；F-4600型荧光分光光度计 日本日立公司；JX-05型拍打式无菌均质器上海净信实业有限公司；BIOBASE-EL10A型自动酶标仪济南中安生物技术服务有限公司；NMI20-015V-I型低场核磁共振仪 上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 暗纹东方鲀的预处理

将鲜活暗纹东方鲀冰水致死，处理后用无菌水清洗，再用体积分数75%乙醇溶液擦拭表面，将所有暗纹东方鲀放在无菌工作台中用紫外线（18 W）照射杀菌30 min进行无菌化处理[10]。

1.3.2 菌悬液制备与菌株接种

分别挑取P.fluorescens、S.putrefaciens单菌落接种于TSB中，37 ℃摇床培养16～18 h，以1%（体积分数，后同）的接种量传代后在37 ℃摇床培养16～18 h直至菌落总数达1×109CFU/mL，分别将P.fluorescens、S.putrefaciens菌悬液以1%的接种量接种于TSB中，37 ℃摇床培养16～18 h直至菌落总数达1×109CFU/mL，分别取P.fluorescens菌悬液、S.putrefaciens菌悬液、等体积的P.fluorescens菌悬液与S.putrefaciens菌悬液，用无菌生理盐水稀释到1×106CFU/mL进行接种，每种菌悬液配制5 L。

将处理好的鱼样随机分成4 组，每组10 条（每2 条鱼用1 L菌悬液进行接种），P.fluorescens接种（P.fluorescensinoculation，PI）组在制备好的P.fluorescens菌悬液中浸渍10 min；S.putrefaciens接种（S.putrefaciensinoculation，SI）组在S.putrefaciens菌悬液中浸渍10 min；联合接种（PI+SI）组：在混合菌悬液中浸渍10 min；对照组（CK）：在无菌水中浸渍10 min，每组10 条。浸渍后沥干，装入无菌聚乙烯袋，于4 ℃贮藏10 d，定期取鱼背部肌肉进行相关指标的分析。在贮藏初期（0 d）、中期（6 d）和末期（10 d）测定IFI并进行MRI分析，其余指标每隔2 d进行测定。

1.3.3 微生物指标的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[11]测定菌落总数、假单胞菌数、希瓦氏菌数。

1.3.4 理化指标的测定

1.3.4.1 pH值

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[12]进行pH值测定，平行测定3 次。

1.3.4.2 TVB-N含量

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[13]进行样品TVB-N含量的测定。

1.3.4.3K值与XOD活力

称取5 g鱼肉样品，参考Huang Zhan等[14]法进行K值参数的测定，按公式（1）计算。XOD活力采用XOD试剂盒测定。

式中：CATP、CADP、CAMP、CIMP、CHxR、CHx分别表示三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinic acid，IMP）、次黄嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）含量/（μmol/g）。

1.3.5 蛋白质指标的测定

1.3.5.1 总巯基含量

总巯基含量参考试剂盒说明书进行测定。

1.3.5.2 肌原纤维碎片化指数

参考时海波等[15]的方法进行测定。2 g鱼肉加入20 mL MFI提取缓冲液，12 000 r/min冰浴均质30 s，12 000×g冷冻离心15 min后重复上述步骤于沉淀中加入15 mL MFI缓冲液混匀，过双层纱布，滤液为肌原纤维蛋白溶液。考马斯亮蓝试剂盒测定其质量浓度，酶标仪测定540 nm波长处的吸光度A540nm，按公式（2）计算MFI。

1.3.5.3 内源荧光强度

参考Cao Yungang等[16]的方法略作修改测定IFI。用20 mmol/L磷酸盐缓冲液将肌原纤维蛋白质量浓度稀释至0.1 mg/mL后进行测定，设置激发波长280 nm，发射波长300～400 nm。

1.3.6 核磁共振成像分析

将鱼块用保鲜膜包裹，放入核磁检测管中。参照Lan Weiqing等[17]的方法进行MRI分析。

1.3.7 致腐能力分析

参考赵宏强等[18]的方法分析两种腐败菌在不同接种方式处理后的致腐能力，以冷藏初期与末期时单位数量腐败菌产生的TVB-N含量为检测指标。腐败代谢产物产量因子由公式（3）计算得出。

1.4 数据处理与分析

利用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行显著性分析和多重比较，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀微生物变化的影响

微生物的生长代谢是导致水产品腐败变质的主因，可通过微生物指标来判定其新鲜度。当菌落总数高于7.0（lg（CFU/g））时，代表鱼不可食用[19]。不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀微生物变化影响如图1所示。

图1 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀菌落总数（A）、假单胞菌数（B）与希瓦氏菌数（C）变化的影响Fig.1 Effects of different inoculation methods on total viable count (A), Pseudomonas count (B) and Shewanella count (C) in refrigerated obscure pufferfish

由图1A可见，CK组样品的初始菌落总数为（3.05±0.05）（lg（CFU/g）），表明其新鲜度较好。而PI组、SI组与PI+SI组样品的菌落总数分别为（3.32±0.10）、（3.33±0.03）、（3.39±0.07）（lg（CFU/g）），且随着贮藏时间的延长，其增长快速。从第2天开始，PI+SI组样品的菌落总数总体显著高于其他组，但在贮藏末期与SI组差异不明显，PI+SI组和SI组在贮藏第8天时的菌落总数已达腐败限值，表明此时腐败产物大量积累，使鱼肉发生腐败变质。其中，3 个接种组在贮藏末期的菌落总数较接近。

各组样品的假单胞菌数（图1B）与希瓦氏菌数（图1C）生长趋势同菌落总数变化相似。SI组从贮藏第6天起，希瓦氏菌数显著高于其他组，并在贮藏结束时达（8.61±0.06）（lg（CFU/g））。Zhuang Shuai等[20]发现新鲜淡水鱼的腐败微生物主要包括假单胞菌、气单胞菌和希瓦氏菌，这些微生物具有较强的致腐能力。还有研究发现，鱼肉腐败时出现的不良风味和有害代谢产物同假单胞菌、希瓦氏菌的产生有关[21]。

2.2 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀pH值与TVB-N含量变化的影响

由表1可知，各组样品的初始pH值在6.52～6.64，贮藏期间呈先降后升趋势。可能由于鱼体死后，乳酸在鱼体内开始堆积，ATP逐渐分解成磷酸等酸性物质，造成pH值降低。而在贮藏中后期，鱼体进入自溶阶段，蛋白质开始分解，氨基酸和胺类等含氮物质大量出现，使pH值升高[22]。由表可见，CK、PI、SI、PI+SI组的pH值先下降，其在贮藏末期分别达到6.72±0.01、6.82±0.02、6.92±0.02和6.89±0.03，3 个接种组样品在贮藏结束时的pH值都显著高于CK组。

表1 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀pH值与TVB-N含量变化的影响Table 1 Effects of different inoculation methods on pH and TVB-N contents of refrigerated obscure pufferfish

TVB-N是由于鱼类死后受到微生物和自身内源酶的作用，蛋白质分解生成的一些碱性含氮类物质，通常微生物的生长与TVB-N含量的升高存在相关性[23]。由表1可知，4 组样品的初始TVB-N含量在8.53～9.67 mg N/100 g，其在整个贮藏过程中均呈增长趋势，这与Li Peiyun等[24]研究结果一致。SI组和PI+SI组样品在贮藏末期的TVB-N含量分别达到（19.95±0.78）mg N/100 g与（20.08±0.24）mg N/100 g。而CK组与PI组样品在贮藏末期的TVB-N含量为（16.91±0.37）mg N/100 g与（17.24±0.44）mg N/100 g。可见，SI组和PI+SI组样品的TVB-N含量显著高于CK组与PI组。

2.3 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀K值与XOD活力变化的影响

K值是反映水产品新鲜度的重要指标。通常认为，K值低于20%为生鲜品，K值在20%～40%为一级鲜度，40%～60%为二级鲜度，高于60%即为腐败变质[25]。由图2可知，样品的初始K值在（5.85±0.28）%，表明其新鲜程度高。4 组样品的K值在贮藏前2 d增长缓慢，随后快速增长，且CK组样品的增长速度明显低于其他3 组。PI+SI组样品在贮藏第10天的K值为（71.64±0.64）%，已超腐败限值，而PI组与SI组样品的K值分别为（65.40±0.88）%和（67.90±0.63）%，此时CK组K值仅为（55.33±0.51）%。由此表明，P.fluorescens和S.putrefaciens可使鱼肉中ATP降解为HxR和Hx，促进微生物的生长代谢，导致其鲜度下降。

图2 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀K值变化的影响Fig.2 Effects of different inoculation methods on K value of refrigerated obscure pufferfish

XOD是催化Hx转化成尿酸的关键酶，可用来评价细菌降解Hx的能力。由表2可知，各组样品的XOD活力在贮藏时间内均有波动，总体呈下降趋势。其中，PI组样品的XOD活力下降后，在贮藏结束时又达到最高值，而PI+SI组样品在贮藏第6天达到最高值，随后又开始下降。由此说明，除鱼类肌肉产生的Hx，还有P.fluorescens会导致Hx的积累。CK组和SI组样品中的XOD活力整体低于PI组，可能由于HxR还未完全转化为Hx。Liu Xiaochang等[26]研究优势腐败菌对冷藏鳙鱼的致腐能力，结果得出XOD活力在贮藏期间也呈波动趋势，与本研究结果一致。

表2 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀XOD活力变化的影响Table 2 Effects of different inoculation methods on XOD activity of refrigerated obscure pufferfish U/g

2.4 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀总巯基含量与MFI变化的影响

由图3A可知，各组总巯基含量随着贮藏时间的延长而降低。贮藏10 d后，CK、PI、SI和PI+SI组样品的总巯基含量相比初始值分别降低38.80%、55.22%、50.58%和55.37%。总巯基含量的降低说明鱼肉蛋白质发生氧化，巯基氧化为二硫键或产生二硫化合物[27]。结果表明，P.fluorescens和S.putrefaciens均会加速蛋白质氧化过程。Qian Yunfang等[28]研究S.putrefaciens对冷藏太平洋白虾的致腐能力，结果得出S.putrefaciens能明显导致肌原纤维蛋白降解。

鱼死后，鱼肉在肌肉中钙蛋白酶的作用下，引起相关肌原纤维蛋白发生降解，造成肌原纤维断裂[29]。MFI可反映肌原纤维断裂的程度。由图3B可知，各组样品的MIF随贮藏时间的延长而升高。3 个接种组的MFI在贮藏后期均显著高于CK组（P＜0.05），尤其是PI+SI组，在贮藏结束时MFI达到54.15±0.21。由结果可知，相比于P.fluorescens，S.putrefaciens更能造成肌原纤维断裂。

图3 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀总巯基含量（A）和MFI（B）变化的影响Fig.3 Effects of different inoculation methods on sulfhydryl content (A)and MFI (B) of refrigerated obscure pufferfish

2.5 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀内源荧光强度变化的影响

色氨酸是一种芳香族氨基酸，存在于天然蛋白质的内核中，可反映蛋白质展开的程度。由于肌球蛋白在头部和杆部存在色氨酸残基，因此内源荧光光谱可用来检测色氨酸的荧光强度和蛋白三级结构变化[30]。由图4可知，各组样品的肌原纤维蛋白在335 nm波长处荧光强度最高。其中，PI+SI组样品在贮藏期间的荧光强度下降明显，贮藏到第10天后，其相比于初始强度下降了46.82%，其次是SI组和PI组。荧光强度的降低与色氨酸吲哚侧链的变性和暴露有关[31]。结果表明，P.fluorescens和S.putrefaciens的接种导致鱼肉蛋白中的色氨酸残基暴露和蛋白质三级结构发生变化。

图4 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀内源荧光光谱变化的影响Fig.4 Effects of different inoculation methods on intrinsic fluorescence intensity of refrigerated obscure pufferfish

2.6 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀MRI图像变化的影响

低场核磁共振结合MRI分析可通过伪彩图亮度变化直观反映鱼肉样品中水分迁移及含量变化情况。通常红色代表高质子密度区域，表明该部分水分含量越高；蓝色代表低质子密度区域，表明水分含量越低[32]。由图5可知，随着贮藏时间的延长，鱼肉的MRI图由红色趋于蓝色，颜色逐渐变暗，表明暗纹东方鲀贮藏期间的持水性开始降低，该变化趋势与Wang Xinyun等[33]的研究结果一致。其中，以PI+SI组样品变化趋势最为明显，其次是SI组，再次是PI组，CK组变化最小。由此可知，微生物的作用促进其品质下降与持水性降低，进一步导致鱼肉的肌肉蛋白变性降解。

图5 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀MRI伪彩图像变化的影响Fig.5 Effects of different inoculation methods on false-color images of water proton density of refrigerated obscure pufferfish

2.7 不同接种方式对冷藏暗纹东方鲀致腐能力的影响

不同腐败菌的生长代谢存在差异，因此，可通过TVB-N含量与菌落总数结合得出的产量因子反映腐败菌的致腐能力。如表3所示，通过产量因子可得出P.fluorescens和S.putrefaciens联合接种组的致腐能力最强，其次是S.putrefaciens，而P.fluorescens的致腐能力最弱。但联合接种与单一接种的产量因子较为相近，可见S.putrefaciens和P.fluorescens联合接种后未表现出明显的协同作用。

表3 不同接种方式的产量因子Table 3 Yield factors for different inoculation methods

3 结 论

本实验主要研究了河鲀鱼中的两种优势腐败菌单一或联合接种对其冷藏期间品质变化影响及致腐能力影响。结果表明，相比于PI组和SI组，PI+SI组中的微生物数量、TVB-N含量与K值增长更为明显，使其蛋白质氧化加速，且水分流失最严重。结合产量因子得出，P.fluorescens和S.putrefaciens联合接种的致腐能力最强，但未表现出明显的协同作用，其次是S.putrefaciens，而P.fluorescens致腐能力最弱。本研究有助于加深对水产品腐败菌相互作用方式的了解，可为后续暗纹东方鲀的冷藏保鲜提供理论参考。