循环miR-130a表达与慢性心力衰竭患者心功能及中医证型的相关性分析*

卢晨君 罗清菊 王建忠

慢性心力衰竭是由于心脏结构和功能改变导致心室充盈或射血分数减少的临床综合征[1]。临床通过心功能分级来判断患者心脏受损严重程度，根据自觉活动能力划分，但心功能分级是一个量化心功能的模糊标准。在中医中属“心悸”“怔忡”“水肿”“喘证”范畴。中医认为随着慢性心力衰竭疾病进程，患者临床上表现的症状不断加重，其病机也在不断变化，另结合病机分为心气虚型、气阴两虚型、气虚痰瘀型、心肾阳虚型[2]。中医病因病机与现代医学的神经内分泌机制在一定程度上是相通的，但准确分型取决于医师经验、水平，对治疗方案选取有一定限制。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码单链小RNA，能在转录后水平对基因表达发挥调控作用。研究发现[3]，miRNAs在心血管疾病(例如心力衰竭、心肌梗死、心律不齐、动脉粥样硬化等)的病理生理学中发挥重要作用。心肌梗死病理过程中，miR-130a表达水平上调促进心肌细胞凋亡；在胚胎心肌细胞中，miR-130a表达上调可能导致心室肌萎缩和心脏结构不规则[4]。研究均证实miR-130a水平与心脏疾病密切相关。因此本研究拟探讨miR-130a与慢性心力衰竭患者心功能及中医证型的相关性分析，旨在为心功能分级及中医证型划分提供量化指标，为慢性心力衰竭患者的诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年8月—2020年8月郑州市中医院心内科收治的慢性心力衰竭患者184例，年龄40～80岁，平均(56.73±10.58)岁。参照美国心脏协会心功能(NYHA)分级[5]，将慢性心力衰竭患者分为Ⅰ级、Ⅱ级67例，Ⅲ级60例，Ⅳ级57例。同时参照《中药新药临床研究指导原则》[6]进行辨证分型，将慢性心力衰竭患者分为心气虚型32例，气阴两虚型50例，气虚痰瘀型61例，心肾阳虚型41例。本研究经道德伦理委员会批准通过，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：①符合慢性心力衰竭诊断标准[7]；②符合中医辨证的舌、脉主要症状及次要症状；③患者近6个月内未服用中药；④临床资料齐全；⑤患者及其监护人知情，签署知情同意书。排除标准：①恶性肿瘤、严重肝功能异常患者；②具有严重血液系统疾病患者；③急、慢性肾功能不全患者；④3个月内有心绞痛病史患者；⑤严重免疫系统紊乱、先天性心脏病患者；⑥肺源性心脏病引起的心衰患者。

1.3 方法

1.3.1 样品收集所有受试者清晨空腹抽取肘静脉血4 ml于试管中，室温静止15 min，3500 r/min离心15 min，分离上清，超低温冻存待检。

1.3.2 qRT-PCR检测血清中miR-130a表达水平采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测血清中miR-130a表达水平。miR-130a上游引物序列：5’-CCAGCCAAAGTAGGAAGGAG-3’，下游引物序列：5’-CCGGAGTTCCTCAGACA-AGAG-3’，内参U6上游引物序列：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。采用试剂盒提取血清总RNA，逆转录合成cDNA，qRT-PCR程序设定为94 ℃预热3 min，94 ℃ 30 s，56℃ 25 s，72 ℃ 20 s，共38个循环。反应体系20 μl∶5×SYBR Green qPCR Mix 4 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，上游引物2.0 μl，下游引物2.0 μl，ddH2O 9.6 μl。miR-130a相对表达量用2-ΔΔCT法计算。

1.4 心功能指标检测采用vivid 7彩色超声诊断仪检测所有研究对象左室舒张内径(Left ventricular end diastolic diameter，LVDD)，左室射血分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。

2 结果

2.1 不同心功能分级患者血清miR-130a表达水平比较与Ⅰ级、Ⅱ级相比，心功能Ⅲ级患者miR-130a表达水平较高(P<0.05)；与Ⅲ级相比，心功能Ⅳ级患者miR-130a表达水平较高(P<0.05)。见表1。

表1 不同心功能分级患者血清miR-130a表达水平比较 (例，

2.2 不同心功能分级患者心功能指标比较与Ⅰ级、Ⅱ级相比，心功能Ⅲ级患者LVEF值较低(P<0.05)，LVDD值较高(P<0.05)；与Ⅲ级相比，心功能Ⅳ级患者LVEF值较低(P<0.05)，LVDD值较高(P<0.05)。见表2。

表2 不同心功能分级患者心功能指标比较 (例，

2.3 血清miR-130a表达水平与心功能指标的相关性心功能指标LVDD值与miR-130a水平呈正相关(P<0.05)，LVEF值与miR-130a水平呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 血清miR-130a表达水平与心功能指标的相关性

2.4 中医辨证分型与心功能分级的关系不同心功能分级患者组间中医辨证分型例数比较，差异具有统计学意义(χ2=90.931，P<0.05)，在心功能Ⅱ级患者中以心气虚型、气阴两虚型为主，在心功能Ⅲ级患者中以气虚痰瘀型为主，在心功能Ⅳ级患者中以心肾阳虚型为主。见表4。

表4 中医辨证分型与心功能分级的关系 (例，%)

2.5 慢性心力衰竭患者中医辨证分型与血清miR-130a表达水平的关系比较与心气虚型相比，气阴两虚型、气虚痰瘀型、心肾阳虚型患者miR-130a表达水平较高(P<0.05)；与气阴两虚型相比，气虚痰瘀型、心肾阳虚型患者miR-130a表达水平较高(P<0.05)；与气虚痰瘀型相比，心肾阳虚型患者miR-130a表达水平较高(P<0.05)。见表5。

表5 慢性心力衰竭患者中医辨证分型与血清miR-130a表达水平的关系比较 (例，

3 讨论

慢性心力衰竭是大多数心脏疾病发展的终末阶段，其发病率不断上升，也是目前我国老年人住院和死亡的主要原因[8]。慢性心力衰竭是由多种原因(炎症、心肌梗死等)引起的心肌损伤，从而引起心脏结构变化及功能丧失，与中医认为慢性心力衰竭形成心气虚衰、积累成损的过程基本一致[9]。中医认为慢性心力衰竭本虚标实，本虚为气虚、气阴两虚、阳虚；标实多见血瘀，兼有痰、饮等，具体证型本虚与标实相互结合。因虚证迁延日久，虚实夹杂，相互为病，导致病情不断进展。

研究报道microRNAS在心血管疾病发生、发展中起着重要作用[10，11]。其亦可通过调节心肌细胞，从而参与心血管疾病的发病过程[12]。miR-130a位于染色体11q12.1上，具有组织特异性。Osbourne等[13]研究发现miR-130a在成年小鼠心脏中过度表达，6周开始出现持续性室性心律失常现象。临床显示，动脉粥样硬化心血管疾病患者的主动脉粥样硬化斑块中miR-130a呈高表达[14]，且病情较重者血浆水平更高[15]。本研究发现慢性心力衰竭患者血清中miR-130a表达水平在心功能Ⅰ级、Ⅱ级，Ⅲ级，Ⅳ级患者中依次显著升高，且Pearson分析发现，miR-130a表达水平与心功能指标LVDD值呈正相关，与LVEF值呈负相关，提示miR-130a可能参与慢性心力衰竭疾病进程。

在慢性心力衰竭临床心衰阶段，病因为心肌细胞基本表达异常导致心肌结构和功能变化，加重疾病程度；难治性终末期心衰阶段则因患者病情恶化，心肌细胞调亡加剧[16]。此外，在心衰初期以心肺气虚证及气阴两虚证较为常见，随着病情进展，气虚导致心阳虚，久病可表现为阳虚等，在此过程中，阳气亏虚、血瘀饮停是慢性心力衰竭疾病的终末期，主要为肾亏。刘玥等[17]研究显示心功能Ⅱ级患者多见心气虚型、气阴两虚型，心功能Ⅲ级患者多见气虚痰瘀型，心功能Ⅳ级患者多见心肾阳虚型。本研究发现在心功能Ⅱ级患者中以心气虚型、气阴两虚型为主，Ⅲ级患者中以气虚痰瘀型为主，Ⅳ级患者中以心肾阳虚型为主，心气虚型、气阴两虚型、气虚痰瘀型、心肾阳虚型患者病情与心功能分级由低到高趋势一致，提示4种分型可能在一定程度上可反应慢性心力衰竭严重程度。且miR-130a表达水平在心气虚型、气阴两虚型、气虚痰瘀型、心肾阳虚型4种分型中水平依次显著升高，提示miR-130a可能作为慢性心力衰竭不同中医证型的分型依据，为中医辨证分型提供客观依据。

综上所述，慢性心力衰竭患者血清miR-130a表达水平呈上调。miR-130a在不同中医证型慢性心力衰竭中表达水平差异有统计学意义，临床进行血清miR-130a检测可能有利于慢性心力衰竭中医分型。但后期将扩大样本数量及研究范围、延长研究时间，弥补此次研究不足，多角度研究慢性心力衰竭中医证型。