无籽刺梨多糖纳米粒制备工艺优化及表征

付阳洋，杨 敏*，汤陆扬，杨培昕，彭黔荣，谢有超

（1.贵州大学药学院，贵州贵阳550025；2.贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵州贵阳550009；3.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025）

无籽刺梨［RosesterilisS.D.Shi］，又名金刺梨、光枝刺梨等，系蔷薇科蔷薇属多年生落叶丛生灌木。在贵州安顺、兴仁等地居多，是贵州省特有刺梨品种。因其果实成熟后，果皮刺脱落，种子败育，被称为无籽刺梨。无籽刺梨果实比普通刺梨果实稍小，但果肉占比大，可食率比高。此外，其果肉粗纤维不发达，风味独特，糖分含量比刺梨高13.3%，单宁含量比刺梨低71.7%，因此，无籽刺梨果实口感甜而不涩，更适合于风味饮品的开发［1-3］。研究表明，无籽刺梨果肉还富含类黄酮、三萜、维生素和氨基酸等多种对人体有益的微量元素［4-5］，具有抗氧化、抗衰老和增强免疫力等功效［6］。

聚乳酸羟基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）是由两种单体乳酸和乙醇酸随机聚合而成，其纳米粒作为药物载体，生物相容性好，具有良好的生物降解性，无刺激性，毒副作用小，经酯键断裂降解为乳酸和羟基乙酸，通过三羧酸循环被代谢为二氧化碳和水从体内排出［7］。在降解时，PLGA纳米粒表面会逐渐产生微孔，使药物暴露在纳米粒表面逐渐溶解释放，达到长效缓释目的［8］。此外，PLGA作为最常用的生物相容性和生物可降解聚合物之一，具有良好的成囊和成膜的性能，被FDA批准为最常用的纳米材料之一，正式作为药用辅料收录进美国药典［9］。

到目前为止，有较多国外文献报道将多糖包载于PLGA纳米粒中，如Luo等［10］制备了山药多糖PLGA纳米粒，发现山药多糖PLGA纳米粒比游离山药多糖更有效的促进淋巴细胞增殖和触发T淋巴细胞向T h细胞转化。Wu sim an等［11］将A l h ag e蜂蜜多糖包封于PL GA纳米粒中能够有效的提高Alhage蜂蜜多糖的免疫效果。Gu等［12］将当归多糖封装于PLGA纳米粒中，与PLGA建立了一个纳米粒药物递送系统，使当归多糖的免疫增强作用得到了显著改善。但是，未见有关无籽刺梨多糖纳米制剂的报道。故在前期实验的基础上，选取使用较为广泛的PLGA为纳米载体，采用双乳化溶剂蒸发法制备了无籽刺梨多糖PLGA纳米粒，并以多糖包封率为考察指标，通过单因素试验和响应面对制备工艺进行优化。以期为刺梨多糖制剂的研发提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

紫外可见分光光度计（UV-5500PC，上海元析仪器有限公司）；电子天平（BSM220.4，上海精卓电子天平有限公司）；电热鼓风干（101-2AB，天津泰斯特仪器有限公司）；离心机（Cence@H1650R，湘仪离心机仪器有限公司）；一体式超纯水系统（PF1XXXXM1，上海威立雅水处理技术有限公司）；超声波清洗器（SY-180，上海宁商超声仪器有限公司）；激光粒度仪（NanoBrook Omni，美国布鲁克海文仪器公司）；高分辨率透射电子显微镜（JEM-2100（UHR），日本电子株式会社仪器有限公司）。

1.2 试验药材与试剂

PLGA（上海源叶生物技术有限公司）；无籽刺梨（贵州省盘县）；泊洛沙姆P188（贵阳四面体化工有限公司）；丙酮（贵阳四面体化工有限公司）；所有化学品和试剂均为分析级。

2 方法

2.1 纳米粒的制备

采用双乳化-溶剂蒸发法［10］制备载药纳米粒和空白纳米粒：首先将多糖溶解到去离子水中（20 mg/mL），形成W1。再将PLGA分散到丙酮中得到O，通过超声作用将W1乳化到O中，超声功率为130 W，超声时间2 s、间隔时间3 s，形成PE。制备0.7%（W/V）的P188溶液，得到W2。在超声功率为150 W，超声时间2 s、间隔时间3 s作用下，将PE乳化到W2中，得到水包油包水（W/OW）的多糖纳米乳液。通过旋转蒸发仪在56℃下，旋蒸除去粗纳米乳液中残留的有机溶剂。随后通过以3500 r/min离心10 min，在上清液中收集多糖PLGA纳米粒。采用同样方法制备内水相中不含多糖的空白PLGA纳米粒。

2.2 包封率和载药量的测定

采用低温高速离心法测定包封率（Encapsula‑tion efficiency，EE）和载药量（Drug loading，DL）。在4℃下以12000 r/min离心30 min分离纳米粒和游离多糖，在上清液中通过硫酸-苯酚法测定游离多糖的含量［11］。将收集的多糖PLGA纳米乳液冷冻干燥，计算纳米粒的总质量。多糖EE计算如公式（1）所示，DL计算如公式（2）所示。

(1)EE%=[(总药量-游离药物量)/总药量]×100%

(2)DL%=[(总药量-游离药物量)/纳米粒总量]×100%

2.3 单因素试验

考察了四个单因素：内水相W1与有机相O的体积比、初级乳PE与外水相W2的体积比、泊洛沙姆P188的浓度和PLGA浓度对多糖PLGA纳米粒包封率的影响。

2.4 优化设计

在单因素试验的基础上，运用Design Expert 8.0.6软件程序，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，以内水相W1与有机相O的体积比（X1）、初级乳PE与外水相W2的体积比（X2）、泊洛沙姆P188的浓度（X3）为自变量，以多糖PLGA纳米粒的包封率为响应值，通过响应曲面分析（Response Surface Analysis，RSA），对纳米粒的制备工艺进行优化。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平编码表Table 1 Response surface analysis factors and levels coding table

2.5 多糖PLGA纳米粒的表征

利用透射电镜观察了纳米粒子的形貌。将多糖PLGA纳米粒冻干粉用蒸馏水溶解稀释，置于铜网上，磷钨酸染色后，透射电镜观察其形态特征［13］；利用激光粒度分析仪测定多糖PLGA纳米粒和空白纳米粒的粒径、粒度分布和Zeta电位。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

通过单因素试验发现，内水相W1与有机相O的体积比、初级乳PE与外水相W2的体积比和P188的浓度对多糖PLGA纳米粒的包封率影响较大，而PLGA的浓度对其包封率影响甚微。四个因素对包封率的影响如下所述。

3.1.1 内水相W1与有机相O的体积比对多糖PLGA纳米粒的包封率的影响

固定初级乳PE与外水相W2的体积比1：9和P188的浓度0.7%。如图1所示，当内水相W1与有机相O的体积比为1：8时，包封率有最大值，且随着有机相O体积增大时，包封率呈现先上升后下降的趋势。

图1 内水相W1与有机相O的体积比对多糖PLGA纳米粒的包封率的影响Fig.1 The influence of the volume ratio of internal water phase W1 to organic phase Oon the encapsulation efficiency of polysac‑charide PLGA nanoparticles

3.1.2 初级乳PE与外水相W2的体积比对多糖PLGA纳米粒的包封率的影响

固定内水相W1与有机相O的体积比1：10和P188的浓度0.7%。如图2所示，当初级乳PE与外水相W2的体积比为1：8时，包封率有最大值，随后包封率逐渐下降。

图2 初级乳PE与外水相W2的体积比对多糖PLGA纳米粒的包封率的影响Fig.2 The influence of the volume ratio of the primary milk PEto the outer water phase W2 on the encapsulation efficien‑cy of polysaccharide PLGA nanoparticles

3.1.3 P188的浓度对多糖PLGA纳米粒包封率的影响

固定内水相W1与有机相O的体积比1：10和初级乳PE与外水相W2的体积比1：9。如图3所示，随着P188浓度的增大，包封率逐渐下降，且在P188浓度为0.3%时包封率最大。

图3 P188的浓度对多糖PLGA纳米粒的包封率的影响Fig.3 The effect of P188 concentration on the encapsulation efficiency of polysaccharide PLGA nanoparticles

3.1.4 PLGA的浓度对多糖PLGA纳米粒包封率的影响

固定内水相W1与有机相O的体积比1：10、初级乳PE与外水相W2的体积比1：9和P188浓度0.7%。如图4所示，PLGA浓度的改变对包封率的影响甚微。

图4 PLGA的浓度对多糖PLGA纳米粒的包封率的影响Fig.4 The effect of PLGA concentration on the encapsulation efficiency of polysaccharide PLGA nanoparticles

3.2 优化设计

3.2.1 响应面试验结果

根据Box-Behnken设计进行了17组实验，其中5组中心点重复，结果见表2。利用Design Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行二次多项回归拟合及对所得数据进行ANOVA分析，试验结果表明，RSSPLGA NPs的包封率与因素X1、X2和X3的二次多项回归方程为：

表2 试验设计及其结果Table 2 Experimental design and its results

该模型和模型系数的显著性检验结果如表3所示。可知，模型F=10.51，P＜0.01，极显著，失拟项为P=0.3293（P＞0.05），不显著，决定系数R2=0.9311，模型校正系数R2Adj=0.8425，说明本试验所选用的二次方程模型具有较高的显著性，可用于预测多糖PLGA纳米粒的制备工艺。由表3可知，各因素中一次项X3对多糖包封率线性效应显著（P＜0.05），二次项中X12、X22是显著（P＜0.05）。此外，由F值知，各因素对无籽刺梨多糖包封率影响为X3＞X1＞X2。

表3 回归模型的方差分析Table 3 ANOVA of regression models

3.2.2 响应面的优化与预测

利用Design-Expert 8.0.6软件绘制2个因素的交互作用对多糖PLGA纳米粒包封率影响的响应面及等高线，结果如图5所示。可知，因素X3对多糖PLGA纳米粒包封率的影响最为显著，其3D曲线最陡峭，其次为因素X1，最后是因素X2。再次，P188浓度与包封率呈反比关系，P188浓度减少，包封率增加，符合单因素试验结果。而内水相W1与有机相O的体积比和初级乳PE与外水相W2的体积比对包封率的影响为先增加后下降的趋势，因此，该两因素需选择在合理范围内。最后，由响应面法优化出多糖PLGA纳米粒最佳制备工艺条件，即X1=1：8.36，X2=1：7.07，X3=0.12%（W/V），在此参数下预测多糖PLGA纳米粒包封率为97.32%。

图5 各因素交互作用对多糖PLGA纳米粒包封率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot of the influence of the interaction of various factors on the encapsulation rate of polysac‑charide PLGA nanoparticles

3.2.3 工艺验证

结合实际操作，将优化后的工艺参数调整为内水相W1：有机相O的比例为1：8，初级乳PE和外水相W2的比例为1：7，泊洛沙姆P188的浓度为：0.10%（W/V），重复3次的包封率分别为95.10%、96.02%、94.12%，平均包封率为95.08%，相对误差为2.31%，实际值与预测值基本吻合，表明了模型对多糖PLGA纳米粒制备工艺条件优化的可行性与准确性。

3.3 多糖PLGA纳米粒的表征

多糖PLGA纳米粒和空白PLGA纳米粒的透射电镜图如图6所示。由图知，多糖PLGA纳米粒和空白PLGA纳米粒均为近似球形，具有较光滑的表面，且为尺寸均匀的颗粒。此时，两种纳米粒子粒径相近约为110 nm。

图6 多糖PLGA纳米粒（A）和空白PLGA纳米粒（B）的透射电镜图Fig.6 TEM images of polysaccharide PLGA nanoparticles（A）and blank PLGA nanoparticles（B）

多糖PLGA纳米粒和空白PLGA纳米粒粒径大小与分布如图7所示，其平均粒径、多分散系数和Zeta电位如表4所示。由表知，载药后的纳米粒子粒径略微增大，多分散系数降低，且Zeta电位绝对值有所提高，表明整个体系更加趋于均匀与稳定。此外，由透射电镜与激光粒度仪所得纳米粒粒径有一定差别，透射电镜测得粒径约为110 nm，激光粒度仪测得粒径约为220 nm。这是由于两种测试方式的区别造成的，透射电镜是对纳米粒进行脱水处理，而激光粒度仪分析的纳米粒为水合的［10］。

图7 多糖PLGA纳米粒（A）和空白PLGA纳米粒（B）的粒径分布图Fig.7 The particle size distribution of polysaccharide PLGA nanoparticles（A）and blank PLGA nanoparticles（B）

表4 多糖PLGA纳米粒和空白PLGA纳米粒的粒径、多分散系数和Zeta电位值Table 4 Particle size，polydispersity coefficient and Zeta po‑tential of polysaccharide PLGA nanoparticles and blank PLGA nanoparticles

4 结论

植物多糖是天然的高分子聚合物，具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、防治糖尿病和降血脂等［14-17］，而多糖纳米制剂的开发不仅能提高其稳定性和生物利用度，还具有靶向性好、生物相容性高的优势［18］。因此，选取无籽刺梨多糖为原料，通过双乳化溶剂蒸发法制备了多糖PLGA纳米粒。在单因素的基础上，利用响应面法对工艺条件优化，得到其制备工艺参数为内水相W1和有机相O的比例为1：8，初级乳PE和外水相W2的比例为1：7，泊洛沙姆P188的浓度为0.1%（W/V）。在该工艺条件下，多糖PLGA纳米粒呈粒径均匀的球形，表面较光滑，包封率高。以空白纳米粒作为对比，发现多糖PLGA纳米粒较空白PLGA纳米粒粒径有所增大，多分散系数减小、Zeta电位绝对值增大，表明多糖PLGA纳米粒体系更加趋于稳定。通过对无籽刺梨多糖PLGA纳米粒的制备工艺进行优化与表征，以期为无籽刺梨多糖纳米制剂的研发与规模化制备提供实验参考。