生物熏蒸配施微生物菌剂对西瓜连作土壤真菌群落结构的影响*

常芳娟,张贵云,张丽萍,吕贝贝,刘 珍,范巧兰,姚 众

(山西农业大学棉花研究所 运城 044000)

西瓜()富含维生物C 等多种营养物质,是世界上重要的园艺作物之一,我国是世界上最大的西瓜生产国和消费国。西瓜连作会影响植株生长发育,增加病虫害发生率,发生产量和品质下降等连作障碍现象。我国耕地面积的限制、西瓜种植业集约化规模化的提高、经济利益的驱使以及生产栽培条件的制约等,均加剧了西瓜连作障碍的发生,严重制约了西瓜产业的健康可持续发展。

研究表明,导致连作障碍的原因复杂多样,土壤中的微生物区系和化学物质发生异常是造成土壤质量下降、连作障碍发生的本质原因,其中,土壤理化性质的劣变以及土传病害的发生是主要的诱导因子。土壤化学熏蒸剂在防控植物土传病害方面有较好的效果,但其长期使用会破坏土壤生态系统,引发人类健康和生态环境的风险。因此,寻找可有效调控土壤微生物区系并解决连作土壤病害问题的绿色方案对西瓜产业的高质量可持续发展有着重要意义。

生物熏蒸是利用十字花科(Brassicaceae)或菊科(Compositae)等植物在分解过程中产生的挥发性生物活性物质抑制或杀死土壤中有害生物的方法。芸薹属()植物植株和果实中含有的硫代葡萄糖苷,在植物组织破碎腐解后,通过土壤微生物作用,被植物细胞中的黑芥子酶水解产生挥发性活性物质异硫氰酸酯,该类物质具有抑制病原真菌、杀灭植物寄生线虫和提高土壤质量及作物产量等作用。Koron 等研究表明,芸薹属植物生物熏蒸可提高土壤有机质和矿质养分,并提高草莓()果实数量和叶片质量。Maxwell 等通过3年研究,发现芥菜型油菜()覆盖显著降低了水稻纹枯病的发病率和严重程度,并显著提高了水稻()产量。

生物熏蒸以其绿色、安全、环保、成本低等优点,引起研究者的广泛关注。然而,土壤微生物间的关系错综复杂,单独生物熏蒸无法保证土壤真菌群落的稳定性,因此,在生物熏蒸的同时添加土壤有益微生物种类或数量,可调控土壤微生物区系向健康稳定方向发展。解淀粉芽孢杆菌()可产生抗菌蛋白类、脂肽类抗生素等抑菌物质,并可通过竞争作用占据有利生态位点,从而提高作物抗病抗逆性、修复土壤微生态环境、促进作物健康生长。Qin 等研究发现解淀粉芽孢杆菌L-S60 显著改变了黄瓜()根际微生物群落结构,并可促进黄瓜幼苗的生长。目前,关于西瓜连作障碍的防治研究多为化学熏蒸或化学熏蒸配施微生物菌剂,尚无生物熏蒸及其配施微生物菌剂相关的研究报道。本课题组在前期研究基础上,采用Illumina HiSeq 高通量测序技术,研究了生物熏蒸及其配施微生物菌剂对连作西瓜土壤化学性质及真菌群落组成和多样性的影响,以揭示土壤真菌群落结构对生物熏蒸及配施微生物菌剂的响应机制,为缓解或克服西瓜连作障碍提供理论依据,保障西瓜产业的可持续健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试油菜品种‘晋黄芥’,芥菜型油菜,为课题组研究筛选出的高硫苷油菜品种。油菜根茎硫苷含量为60.82～70.64 μmol∙g,油菜籽硫苷含量95.40 μmol∙g。

解淀粉芽孢杆菌菌剂,有效成分含量1.2 亿芽孢∙g,江苏省苏科农化有限责任公司生产。

1.2 试验设计

试验地位于山西省运城市闻喜县畖底镇西颜村,该地土壤类型为褐土,是传统的精耕细作农业区,试验前已连续种植两年西瓜。试验设置3 个处理,分别为:生物熏蒸处理(R)、生物熏蒸+解淀粉芽孢杆菌菌剂处理(RB)、空白对照(CK),每处理3 个重复,每小区面积45 m。R 处理2019年4月2日将达到终花期的油菜(12 000 kg∙hm)粉碎,翻埋,浇水(450 m∙hm),覆盖薄膜,4月12日揭膜,通风敞气10 d,4月22日覆膜播种西瓜; RB 处理在R 处理的基础上,于西瓜播种时加施解淀粉芽孢杆菌菌剂,每穴施入6 g。供试西瓜品种为‘欧洲风暴’,行距2.5 m,株距45 cm,每小区定植40 株西瓜,田间管理照常规进行。

1.3 土壤样本采集

于西瓜初花期(2019年6月9日),分别采集生物熏蒸处理(R)、生物熏蒸+解淀粉芽孢杆菌菌剂处理(RB)和空白对照(CK)的西瓜根围土样,每小区采用 “X”型5 点取样法。移去表层土壤,用土钻从5～20 cm土层垂直采集西瓜根部周围0～5 cm 范围土壤,每点采集3 份土样,除去其中植物残体、碎石及其他杂物等,充分混匀后装入塑封袋中贴标签放入冰盒中带回实验室。一部分土样于−80 ℃冰箱保存,用于土壤真菌群落结构的分析。另一部分土样自然风干后过2 mm 筛,用于土壤化学性质的测定。

1.4 测定方法

土壤pH 测定采用电位法,碱解氮(AN)测定采用碱解扩散法,有效磷(AP)测定采用0.5 mol∙LNaHCO浸提-钼锑抗比色法,速效钾(AK)测定采用NHOAc 浸提-火焰光度法,全氮(TN)测定采用凯式定氮法,有机质(OM)测定采用重铬酸钾容量法。

土壤真菌总DNA 提取采用MN NucleoSpin 96 Soi 试剂盒,按说明书步骤进行。采用真菌ITS1 通用引物(F:5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3,R:5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)对土壤真 菌ITS1 区进行扩增。目标区域PCR 反应体系为10 μL:样品DNA 50 ng、上游和下游引物(10 μmoL∙L)各0.3 μL、KOD FX Neo Buffer 5 μL、dNTP (2 mmol∙Leach) 2 μL、KOD FX Neo 0.2 μL、ddHO 补至10 μL。PCR 反应条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃40 s,25 个循环; 72 ℃ 7 min。将目的区域 PCR 纯化后进行Solexa PCR 扩增,反应体系为20 μL:目的区域 PCR 纯化产物5 μL,Solexa Primer 引物(2 μmoL∙L)各2.5 μL,2×Q5 HF MM 10 μL,ddHO 补至20 μL。PCR 反应条件:98 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃30 s,10 个循环; 72 ℃ 5 min。将第二次PCR 扩增产物进行定量、混样、纯化后,用1.8%的琼脂糖凝胶,120 V 40 min 电泳后,切目的片段用Monarch DNA 试剂盒回收。利用 Illumina HiSeq 测序平台进行高通量测序,测序委托北京百迈克生物科技有限公司完成。

将测序得到的原始序列进行双端拼接、过滤去除嵌合体后得到高质量序列,使用Usearch 软件对高质量序列在97%的相似度水平下进行聚类,划分OTU,并基于微生物分类学数据库分析每个OTU 对应的物种分类信息,进而获得各分类水平上各样品的群落组成,利用QIIME 软件生成不同分类水平上的物种丰度表,利用R 语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图。使用Mothur 软件和R 语言工具对样品进行Alpha 多样性分析,研究单个样品内部的物种丰度及物种多样性,得到各样品Alpha 多样性指数值,绘制样品稀释曲线。使用QIIME 软件进行 Beta 多样性分析,根据距离矩阵获得相应距离下的样品层次聚类(UPGMA)树。并通过相关性与关联分析研究菌群与环境因子之间的关系。进而评估生物熏蒸及配施微生物菌剂对西瓜连作土壤真菌群落组成和多样性的影响。以上分析均在BMKCloud云平台网站上完成。采用SPSS 17.0 和Microsoft Excel进行实验数据的分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤化学性质的影响

不同处理土壤化学性质如表1 所示。与CK 相比,R 和RB 处理的土壤pH 有所降低,而碱解氮、有效磷、速效钾、全氮及有机质含量均有提高,提高幅度分别为4.35%和19.13%、42.31%和10.77%、29.30%和 16.83%、 15.67%和 10.67%、 9.28%和5.10%,除全氮含量显著增加外,其他差异均未达显著水平。R 与RB 相比,有效磷、速效钾、全氮、有机质含量均表现为R>RB,碱解氮含量为RB>R。说明高硫苷油菜作为绿肥,改善了土壤的理化性质,提高了土壤肥力。

表1 不同处理土壤化学性质分析Table 1 Analysis of chemical properties of soil under different treatments

2.2 不同处理土壤真菌群落丰度和多样性分析

稀释性曲线是表征样品测序数据量是否充分,能否足以反映样品中物种多样性的重要依据。由图1可知,3 个土壤样品的OTU 数随测序数量的增加快速上升,当抽取的序列条数达40 000 条以上时,稀释曲线趋于平缓,表明样品序列充分、数据合理,增加更多的测序量对OTU 数增多的贡献率也较小,当前测序量能充分反映出3 个样品真菌群落物种多样性和丰富度的真实信息。

图1 不同处理土壤样品稀释曲线Fig.1 Soil fungal rarefaction curves of different treatments

对测序的有效序列在97%的相似度水平下聚类获得的OTU 分布Venn 图(图2)显示,3 个处理共产生794 个OTU,其中,共有的OTU 为720 个,占OTU总数的90.68%。CK、R 和RB 的OTU 数分别为778、753 和755,CK、R 和RB 特有的OTU 数分别为15、5 和2。CK 与RB、CK 与R、R 与RB 共有的OTU数分别为744、739 和729 个,CK 与RB 的共有数最高。说明生物熏蒸及其配施微生物菌剂均不同程度地降低了西瓜连作土壤真菌群落种类和数量,添加微生物菌剂可一定程度上稳定西瓜连作土壤真菌群落结构。

图2 不同处理土壤真菌Venn 图Fig.2 Venn diagrams of soil fungal community under different treatments

Alpha 指数可反映单个样品内物种的丰度(ACE和Chao1 指数)和多样性(Shannon 和Simpson 指数)。本试验测序覆盖率均达99%以上,说明本次测序结果能反映样本土壤中真菌群落的实际情况。由表2可知,土壤真菌群落丰度和多样性指数均表现为R

表2 不同处理土壤真菌群落丰度和多样性指数Table 2 Abundance and diversity indexes of soil fungal communities of different treatments

2.3 不同处理土壤真菌群落结构分析

不同处理土壤真菌门水平的群落组成及分布如图3 所示。门分类水平共检测出10 个菌门,其中子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)为3 个主要菌门,在R、RB 和CK 中这3 类菌群所占比例分别为96.17%、95.71%和95.14%。相对丰度最高的为子囊菌门,在各处理中所占丰度比例大小依次为RB (79.24%)>R(75.80%)>CK (75.60%),处理间差异达显著水平(<0.05); 被孢霉门在3 个处理间的相对丰度为7.57%～8.10%,各处理间差异不显著。RB 处理显著降低了担子菌门的比例,与CK 相比,降低25.96%(<0.05)。未分类菌门所占比例为2.74%～4.13%,在各处理中相对丰度表现为R

图3 不同处理土壤真菌门水平的群落组成及分布Fig.3 Composition and distribution of soil fungal communities at phylum level in different treatments

不同处理土壤真菌群落在科水平上差异如图4所示。丰度前5 的科分别为毛壳菌科(Chaetomiaceae)、从赤壳科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和柔膜菌科(Helotiaceae),其中毛壳菌科真菌是试验地连作西瓜土壤中的主要菌群,其在RB 处理土壤中的相对丰度最高,其次为R 处理土壤,与CK 相比,相对丰度分别增加11.80%和6.66%。被孢霉科在3 个处理间的相对丰度为7.39%～7.98%,各处理间差异不显著。R 和RB处理均不同程度增加了土壤中小囊菌科的相对丰度,RB 处理还显著增加了从赤壳科的相对丰度(<0.05),降低了柔膜菌科在土壤的相对丰度。其他菌科真菌(15.12%～19.47%)及未分类菌科(6.44%～8.64%)真菌在生物熏蒸及其配施微生物菌剂后相对丰度均有不同程度降低。

图4 不同处理土壤真菌科水平的群落组成及分布Fig.4 Composition and distribution of soil fungal communities at family level in different treatments

采用UPGMA 对样品进行聚类分析,结果表明(图5),土壤真菌群落聚类分为两支,RB 与CK 的真菌群落间遗传距离较近,群落组成相似度高,聚为一支,而R 则独立为一支。说明高硫苷油菜熏蒸可改变土壤真菌群落结构,而添加微生物菌剂后可调节土壤微生物群落组成,使土壤真菌群落向稳定和多样化方向发展。

图5 不同处理土壤真菌群落相似性聚类树Fig.5 Similarity cluster trees of soil fungal community in different treatments

2.4 不同处理土壤真菌群落与土壤环境因子的关联分析

RDA 分析可直观地反映土壤真菌群落与环境因子之间的相关性。如图6 所示,第一、二排序轴对土壤真菌群落变化的解释率分别为23.32%和17.87%,总解释率达41.19%。有机质(OM)含量与土壤真菌群落结构的相关性最大,全氮(TN)、速效钾(AK)和pH 次之,有效磷(AP)和碱解氮(AN)的影响较小。pH 与AP、TN 与AK 的矢量箭头之间夹角为锐角,表明其间可能具有协同效应。3 个处理中,RB 的3个样本距离较近,CK 的3 个样本距离较远,可能与菌群空间分布的复杂性和不均匀性相关。

图6 不同处理土壤真菌群落与土壤环境因子的关联分析Fig.6 Redundancy analysis for fungal groups and soil environmental factors under different treatments

3 讨论

油菜是我国广泛种植的芸薹属植物,作为绿肥还田有较好的土壤培肥优势。土壤养分是物质循环和能量流动的主要驱动力,土壤pH、全氮、碱解氮、速效钾、有机质和有效磷等为土壤基本化学指标,可反映土壤肥力,进而直接或间接地影响土壤微生物群落组成和作物生长。本研究结果表明,生物熏蒸及其配施微生物菌剂均降低了土壤pH,提高了土壤碱解氮、有效磷、速效钾、全氮及有机质的含量,这与Koron 等、刘哲辉等的研究结果一致。这可能是油菜作为绿肥,磷钾含量高,可活化土壤中难溶性磷,干物质碳氮比适中,在土壤中分解直接为土壤带来了部分氮磷钾等营养元素; 另一方面,微生物是土壤养分重要的源和汇,油菜绿肥还田促进了土壤微生物的代谢活动,这些微生物的活动又影响了土壤营养元素含量。本研究中RDA 分析结果表明有机质、全氮、速效钾和pH 为影响土壤真菌群落结构的关键因子,其中有机质的影响最大。土壤有机质是农田肥力的基础和核心,油菜绿肥还田可提高土壤有机质。宋以玲等还发现施用复合微生物菌剂可降低土壤pH,提高土壤有效养分和有机质含量。林叶春等研究表明土壤pH 和有机质含量是影响植烟土壤微生物群落结构变化的主要因素,这均与本研究结果相似。土壤微生物对外界环境变化十分敏感,傅海平等通过研究绿肥间作对茶树()根际土壤真菌群落结构的影响发现,全磷、有效磷、有机质、全氮和碱解氮是影响真菌群落结构的主要因素,这与本研究相异,可能是因气候、地理环境、土壤养分等的差异造成的。

土壤真菌是土壤中重要的微生物,在分解有机质、养分循环和交换、植物土传病虫害生物防治及促进植物生长发育等方面发挥着重要作用。Hollister 等研究发现,芥菜籽粕能显著影响土壤微生物群落结构,使真菌群落丰富度降低60%以上。张春怡等的研究结果表明,生物熏蒸结合微生物菌剂可降低茄子()连作土壤真菌群落的丰富度和多样性,减少土传病原菌的比例,增加

有益菌相对丰度,驱动土壤真菌群落的生态演替。本研究中,高硫苷油菜生物熏蒸降低了连作西瓜土壤真菌群落的丰富度和多样性,配施解淀粉芽孢杆菌菌剂后,使真菌群落的丰度和多样性有所提升,同时UPGMA 聚类分析发现,RB 与CK 的真菌群落结构相似度较高,这与张庆华等的研究结果相似。说明生物熏蒸及其配施微生物菌剂在一定程度上可影响微生物群落组成和多样性。 这可能是生物熏蒸具有广谱性,释放的抑菌活性物质在杀灭土壤病原菌的同时,也降低了有益菌群的比例,而微生物菌剂的加入为土壤微生物环境注入了新的活力,在发挥生防潜能的同时有益于调节微生物群落结构向健康可持续方向发展。

油菜绿肥还田可刺激土壤微生物活性,影响微生物群落结构。Campanella 等研究发现,芸薹属植物作为绿肥破碎翻压到土壤后,小麦()根腐病菌和小麦雪霉叶枯病几乎完全灭绝,镰刀菌(spp.)种群数量也显著降低; Robert等研究表明,高硫代葡萄糖苷的芥菜混合物可显著减少马铃薯()黄萎病发病率,并可减少其他土传病害如马铃薯黑痣病和疮痂病的发生。本研究中,土壤真菌群落组成结果分析表明,子囊菌门、担子菌门和被孢霉门为3 个主要菌门,其中,相对丰度最高的为子囊菌门。生物熏蒸显著增加了土壤中子囊菌门和担子菌门真菌的相对丰度,配施微生物菌剂后子囊菌门真菌相对丰度增加,担子菌门真菌相对丰度有所降低,这与胡洪涛等的研究结果相似。子囊菌和担子菌多为土壤腐生真菌,在土壤木质素含量较高的环境中为优势菌,是复杂化合物及有机质的重要分解者,在养分循环中担任着重要角色。担子菌可高效分解木质化植被碎屑,其滑锈伞属()、丝膜菌属()可与植物共生形成菌根,增强植株抗性。推测子囊菌和担子菌的增加与土壤有机质含量和土壤肥力的提升有关,这可能是高硫苷油菜的绿肥作用,纤维素和木质素等有机物随秸秆的输入促进了腐生真菌的活动,使子囊菌和担子菌菌群得到快速增长与繁殖。而解淀粉芽孢杆菌菌剂的加入,可能抑制了担子菌门中导致植物病害的真菌生长繁殖,如瓜亡革菌()。

研究表明,毛壳菌科中的毛壳菌(spp.)可降解纤维素、木质素等有机物,在防治植物病害方面也极具发展潜力。Joong-Hyeop 等从球毛壳菌() F0142 中分离得到的抑菌活性物质对稻瘟病和小麦叶锈病有较好的防效,并对番茄晚疫病菌也有一定的控制作用。本研究中,土壤真菌群落科水平上,毛壳菌科为主要优势菌群,在高硫苷油菜生物熏蒸配施解淀粉芽孢杆菌菌剂处理土壤中的相对丰度最高，其次为单独生物熏蒸土壤。这与张春怡等关于芸薹属植物可增加土壤中毛壳菌丰度的研究结果一致。黎妍妍等也发现解淀粉芽孢杆菌YH-22 可促使土壤中毛壳菌、木霉菌等有益菌的比例上升。此外,本研究发现R 和RB 处理均增加了土壤中小囊菌科的相对丰度,RB 处理还显著增加了从赤壳科的相对丰度,降低了柔膜菌科在土壤中的相对丰度。从赤壳科、小囊菌科、柔膜菌科均为子囊菌门真菌,在自然界循环中起到降解腐烂有机质、纤维素等的作用。柔膜菌科真菌多数为腐生菌,少数可寄生,引起植物病害,如Minji等和Andrej 等均发现其薄盘菌属()中的可导致严重的松树(spp.)枯梢病。说明微生物菌剂通过调节土壤微生物群落结构,在促进有益菌繁殖的同时抑制或杀灭了有害病原菌,从而减轻土传病害。

4 结论

本研究利用高通量测序技术,揭示了生物熏蒸及其配施微生物菌剂对连作西瓜土壤真菌群落结构的影响机制。生物熏蒸及生物熏蒸配施微生物菌剂降低了土壤pH,提高了土壤碱解氮、有效磷、速效钾、全氮及有机质的含量,其中有机质、全氮、速效钾和pH 为影响土壤真菌群落结构的主要因子。西瓜连作土壤中优势菌门为子囊菌门、担子菌门和被孢霉门,生物熏蒸可显著降低土壤真菌群落丰富度和多样性,配施解淀粉芽孢杆菌菌剂可调节西瓜连作土壤微生物群落结构,提高真菌群落丰度和多样性,使连作土壤微生物区系朝健康稳定方向发展。本研究为生物熏蒸配施微生物菌剂在实际生产中的应用提供了一定的参考依据,为缓解或克服西瓜连作障碍提供了有效的措施。但西瓜连作土壤细菌群落结构对生物熏蒸配施微生物菌剂的响应机制还有待研究,因此在后续工作中,将进一步研究生物熏蒸配施微生物菌剂对常见西瓜土传病害的调控机制,为保障西瓜产业高质量可持续发展提供有效方案。