富氢液腹腔注射对心肌缺血/再灌注大鼠急性肺损伤的预防作用及其机制

王树志，李丽华，付乃宽

天津市胸科医院，天津市心血管病研究所心功能科，天津 300222

心肌缺血/再灌注损伤是急性冠脉综合征、心外科手术、经皮冠状动脉介入术、心肺复苏等临床治疗中常见并发症。心肌缺血/再灌注损伤时过度炎性反应释放大量炎性因子，可经循环系统转运至其他重要脏器［1］。迁移的炎性因子可诱导大量中性粒细胞活化聚集并浸润肺组织，进一步释放大量炎性因子，产生炎症级联反应，表现为肺上皮细胞损伤、毛细血管通透性改变及肺水肿等［2-3］。氢气作为自然界最小的分子，具有明显的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用［4］。研究表明，2% 氢气吸入可通过抑制炎症反应和氧化应激来减轻脓毒症小鼠肺损伤［5］。血红素氧合酶-1（HO-1）是一种内源性保护蛋白，其具有明显的抗氧化、抗炎及抑制细胞凋亡等作用［6］。研究发现，氢气治疗可通过上调HO-1抑制炎症反应来减轻脓毒症小鼠肺损伤［7］。然而，目前尚无富氢液对心肌缺血/再灌注大鼠急性肺损伤影响的研究。2019年6—12月，我们在大鼠心肌缺血/再灌注急性肺损伤前给予富氢液，观察大鼠肺损伤程度以明确富氢液是否具有预防肺损伤作用，同时检测炎性因子以及HO-1，以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 成年雄性SD 大鼠（220～250 g，中国军事医学科学院实验动物中心。主要试剂：锌原卟啉（ZnPPIX，Sigma 公司，美国），ELISA 试剂盒（Elabscience 公司，武汉），蛋白定量试剂盒（Bio-Rad公司，美国），苏木素染液（迈新生物有限公司，福州），一抗鼠单抗HO-1（Abcam 公司，英国），兔单抗β-actin（华安公司，杭州），羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（中杉金桥生物有限公司，北京）。主要仪器：DW-2000 型动物呼吸机（嘉鹏科技有限公司，上海），生物机能实验系统（泰盟软件有限公司，成都），GCH-500 型高纯氢气发生器（同普分析仪器科技有限公司，天津），MK3 酶标仪（Thermo 公司，美国），光学显微镜（Olympus 公司，日本），Gel-pro 图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）。

1.2 大鼠分组、心肌缺血/再灌注模型建立及富氢液腹腔注射 SD 大鼠按随机数字表法分为心肌缺血/再灌注+ 富氢液+ HO-1 抑制剂组（抑制剂组）、心肌缺血/再灌注+ 富氢液组（HS组）、心肌缺血/再灌注组（I/R组）和假手术组（S组）各18例。

采用冠脉结扎术建立心肌缺血/再灌注急性肺损伤模型［8］，腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠后，气管插管行机械通气，皮下电极监测Ⅱ导联心电图。大鼠开胸后置于手术台稳定10 min，以利于大鼠适应，于左锁骨中线处切开胸壁，分离左前降支并穿线，稳定10 min后结扎其30 min，松开结扎线再灌注120 min，左前降支结扎成功的标准：心前区变白，心电图ST 段弓背向上抬高（＞0.12 mV），再灌注成功标准：ST段下降1/2以上，心尖复红。

抑制组大鼠在冠状动脉结扎术前30 min腹腔注射锌原卟啉（25 mg/kg），于再灌注前5 min腹腔注射富氢液10 mL/kg［9］（使用GCH-500 高纯氢气发生器制备氢气，将生理盐水置于高纯氢气环境中，在0.4 MPa 压力下暴露4 h，至氢饱和状态，γ 射线消毒灭菌。富氢液含氢浓度为0.6 mmol/L）。HS组大鼠于再灌注前5 min 腹腔注射富氢液10 mL/kg。I/R 组大鼠分离左冠状动脉前降支并结扎30 min 后，松开结扎线再灌注120 min。S组大鼠仅穿线不结扎。心肌缺血/再灌注诱导急性肺损伤模型制备成功的标准：BALF、肺湿/干重比增加：肺血管通透性和肺水肿程度增加；肺组织病理学检查：肺细胞结构紊乱，肺间质和肺泡水肿，肺泡内及肺泡壁充血、实变，肺间质渗出严重。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 大鼠BALF 总蛋白检测 再灌注2 h 时，取上述大鼠麻醉后，用0.5 mL PBS灌洗右侧肺，重复3次，收集灌洗液，4 ℃下1500×g 离心15 min，取上清液，采用蛋白定量试剂盒测定大鼠BALF总蛋白。

1.3.2 大鼠肺组织病理评分测算 再灌注2 h，取上述大鼠左肺组织，甲醛固定6 h，石蜡包埋切片后，行苏木素—伊红（HE）染色，光学显微镜（×40）下观察肺组织病理改变，评分包括肺组织水肿、充血、中性粒细胞迁移和浸润、肺泡内出血、实变及增生情况，每项评分按损伤程度分为0、1、2和3分，取各项评分总和。

1.3.3 大鼠肺组织湿/干重比检测 再灌注2 h时，每组取6只大鼠，麻醉后取左肺组织，生理盐水充分漂洗，滤纸吸干多余水分，称湿重，恒温干燥箱80 ℃烘烤24 h称干重，计算肺组织湿/干重比值（W/D）。

1.3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10 检测 再灌注2 h时，每组取6只大鼠，采集下腔静脉血样2 mL，4 ℃下3000×g 离心15 min，取血清。参照ELISA 试剂盒检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10。

1.3.5 大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-10 和HO-1 检测 再灌注2 h 时，取上述大鼠右肺组织，匀浆后，4 ℃下10000×g 离心15 min，取上清液。参照ELISA试剂盒检测大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-10和HO-1。

1.3.6 大鼠肺组织HO-1 蛋白检测 采用Westerm blotting 法。再灌注2 h 时，每组取6 只大鼠，麻醉后取左肺组织并称重，加入含蛋白酶抑制剂RIPA 裂解液，匀浆，4 ℃下14000 r∕min离心15 min，取上清为总蛋白。BCA 法蛋白定量后保存于-80 ℃冰箱备用。 取50 μg 蛋白样品，加入4×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，然后进行凝胶电泳1 h，转膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗鼠单抗HO-1（稀释度1∶1000）和兔单抗β-actin（稀释度1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST清洗5次×5 min，加入羊抗小鼠二抗（稀释度l∶2000）或羊抗兔二抗（稀释度1∶2000），室温孵育1 h，ECL 显影，采用Gel-pro 图像分析软件测定条带灰度值，以目的条带灰度值与β-actin 灰度值的比值来反映目的蛋白的表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。正态性分布检验采用shapiro-Wilk法，符合正态分布的计量资料以xˉ± s 表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BALF 总蛋白含量、肺组织病理评分及肺W/D 比较 与S 组相比，I/R 组、HS 组、抑制剂组大鼠BALF 总蛋白含量、肺组织病理评分及肺W/D 均高（P均＜0.05），提示肺组织出现损伤。与I/R组相比，HS组大鼠BALF总蛋白含量、肺组织病理评分和肺W/D 均低（P均＜0.05）。与HS 组相比，抑制剂组大鼠BALF 总蛋白含量、肺组织病理评分及肺W/D均高（P均＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠肺组织BALF总蛋白含量、肺组织病理评分、W/D比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织BALF总蛋白含量、肺组织病理评分、W/D比较（±s）

注：与S 组比较，aP ＜0.05；与I/R 组比较，bP ＜0.05；与HS 组比较，cP＜0.05。

组别抑制剂组HS组I/R组S组BALF总蛋白（mg/mL）5.13 ± 0.82ac 2.67 ± 0.52ab 6.16 ± 0.68a 0.42 ± 0.08肺组织病理评分（分）8.67 ± 1.24ac 4.54 ± 1.32ab 9.85 ± 1.57a 0.62 ± 0.36 W/D 5.82 ± 0.67ac 4.26 ± 0.56ab 6.52 ± 0.53a 3.14 ± 0.26

2.2 各组大鼠血清和肺组织TNF-α、IL-1β及IL-10水平比较 与S组相比，I/R组、HS组、抑制剂组大鼠血清和肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10水平均高（P均＜0.05）。与I/R组相比，HS组大鼠血清和肺组织TNF-α、IL-1β水平均低，IL-10水平高（P均＜0.05）。与HS组相比，抑制剂组大鼠血清和肺组织TNF-α、IL-1β水平均高，IL-10水平低（P均＜0.05），见表2、表3。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较（±s）

注：与S组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05；与HS组比较，cP＜0.05。

组别抑制剂组HS组I/R组S组TNF-α（pg/mL）289.56 ± 33.59ac 186.73 ± 24.53ab 335.15 ± 32.87a 15.36 ± 1.85 IL-1β（pg/mL）315.57 ± 34.63ac 201.72 ± 6.91ab 365.63 ± 38.28a 19.62 ± 1.94 IL-10（pg/mL）33.36 ± 8.23ac 62.95 ± 7.56ab 30.56 ± 4.27a 16.62 ± 1.34

表3 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较（±s）

注：与S组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05；与HS组比较，cP＜0.05。

组别抑制剂组HS组I/R组S组TNF-α（pg/mg·prot）573.43 ± 38.62ac 313.37 ± 36.56ab 626.86 ± 45.48a 19.45 ± 2.04 IL-1β（pg/mg·prot）603.33 ± 42.86ac 336.26 ± 32.84ab 653.35 ± 48.54a 26.36 ± 3.45 IL-10（pg/mg·prot）47.36 ± 4.12ac 95.39 ± 5.52ab 45.74 ± 4.35a 13.34 ± 1.25

2.3 各组大鼠肺组织HO-1 水平比较 与S 组相比，I/R组、HS组、抑制剂组大鼠肺组织HO-1蛋白浓度和水平均高（P均＜0.05）。与I/R组相比，HS组大鼠肺组织HO-1 蛋白浓度和水平均高（P均＜0.05）。与HS 组相比，抑制剂组大鼠肺组织HO-1 蛋白浓度和水平低（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肺组织HO-1蛋白水平比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织HO-1蛋白水平比较（±s）

注：与S组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05；与HS组比较，cP＜0.05。

组别抑制剂组HS组I/R组S组HO-1蛋白（pmol/mg）9.3 ± 2.1ac 19.6 ± 4.5ab 9.8 ± 1.8a 4.5 ± 0.9 HO-1蛋白1.64 ± 0.13ac 1.96 ± 0.18ab 1.65 ± 0.16a 1.00 ± 0.00

3 讨论

冠脉结扎术是建立心肌缺血/再灌注损伤的经典模型。心肌缺血/再灌注时造成心肌损伤的同时可激活机体发生炎性反应并释放大量炎性因子，炎性因子经循环系统作用于相邻和远端脏器［3］。急性肺损伤是指各种因素导致的弥漫性肺间质和肺泡水肿，主要表现为肺顺应性降低、渗出性病变等。本研究发现心肌缺血/再灌注后大鼠支气管肺泡灌洗液总蛋白浓度高，肺W/D 高，表明肺血管通透性和肺水肿程度增加；同时肺组织病理学检查显示肺细胞结构紊乱，肺间质和肺泡水肿，肺泡内及肺泡壁充血、实变，肺间质渗出严重，可见大量炎性细胞浸润，表明大鼠心肌缺血/再灌注后发生了急性肺损伤。

缺血/再灌注早期，炎症因子经循环系统至肺组织，可诱导大量中性粒细胞聚集，发生炎症级联反应，还可激活肺组织发生氧化应激，导致肺上皮细胞损伤、肺毛细血管通透性增加、肺水肿等。因此，调控炎症介质的释放是改善心肌缺血/再灌注后自身和远隔脏器损伤的关键因素。炎性反应中，不同炎性因子可发挥不同作用：促炎因子TNF-α、IL-1β 等可促进炎性反应的发展，放大炎性效应；抗炎因子IL-10 等则能抑制炎性细胞的活性，减轻炎性反应。本研究结果表明心肌缺血/再灌注后，I/R 组大鼠血清和肺组织促炎因子TNF-α和IL-1β含量明显增高，与肺组织损伤表现一致，而血清和肺组织抗炎因子IL-10也部分增高，表明心肌缺血/再灌注同时激活了肺组织的促炎和抗炎反应，并与肺组织损伤密切相关。

氢气作为一种新型的医疗作用气体分子，具有抗氧化应激、抗炎、抗凋亡以及调控基因表达和信号通路等作用，其已被证实对多种疾病具有防治作用。 研究发现，富氢液可通过抑制TLR4/MyD88 信号通路来降低肺组织TNF-α、IL-1β 等炎性因子水平，改善大鼠内毒素性急性肺损伤。本研究发现于心肌缺血/再灌注后，给予富氢液处理组大鼠血清和肺组织促炎因子TNF-α、IL-1β 含量明显降低，抗炎因子IL-10 明显增高，肺组织损伤明显减轻，表明富氢液可抑制心肌缺血/再灌注诱发的肺组织炎性反应，并促进抗炎反应。

HO 是机体对抗损伤、细胞应激、炎症等伤害性刺激的重要保护系统。HO-1 能催化血红素代谢生成胆绿素、铁和一氧化碳，这些代谢产物均有抑制氧化应激和炎症反应的作用。研究表明氢气治疗可通过上调HO-l来抑制炎症反应，进而减轻脓毒症小鼠肺损伤，而给予HO-1 抑制剂ZnPPIX 后可部分逆转氢气对脓毒症肺损伤的保护作用［7］。此外，腹腔注射ZnPPIX（25 mg/kg）也可明显抑制脂联素对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用。本研究发现给予富氢液处理后，心肌缺血/再灌注大鼠肺组织HO-1 蛋白浓度和水平均明显提高，炎症水平明显降低，抗炎水平提高；而给予HO-1 抑制剂ZnPPIX 后，肺组织HO-1蛋白浓度和水平均显著减低，炎症水平又明显升高，抗炎水平降低，表明富氢液可减轻心肌缺血/再灌注大鼠肺组织炎症，并与上调HO-1有关。

综上所述，富氢液处理可明显减轻心肌缺血/再灌注大鼠肺组织损伤，其机制可能与上调HO-1减轻肺组织炎性反应有关。因此，富氢液可能是预防心肌缺血/再灌注诱导急性肺损伤的一种有效措施。