毛细支气管炎患儿血清IL-35、Th2类细胞因子水平变化及其意义

汪廉，孙明月，彭万胜

蚌埠医学院第一附属医院儿科，安徽 蚌埠 233004

毛细支气管炎是一种婴幼儿常见的呼吸系统疾病，临床上主要表现为喘息、气促及三凹征等［1］，主要由呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起。全球每年约有300 万儿童因患毛细支气管炎住院治疗，其中有6～20万儿童最终因其死亡［2］。毛细支气管炎与免疫反应密切相关，Th1/Th2 免疫失衡被认为是毛细支气管炎的主要发病机制，表现为免疫反应向Th2 型反应偏移，IL-4 等Th2 类炎症性细胞因子的水平升高［3］。

有研究表明，IL-35可促进调节性T 细胞（Tregs）的分泌，抑制Th2 类细胞因子介导的炎症反应［4］。IL-35 是由Tregs 及多种免疫调节细胞分泌的细胞因子，为p35 与EBI3 亚基结合形成的异二聚体，属于IL-12 家族［5-6］。IL-35 通过与T 细胞上的受体结合产生效应，在炎症性肠病、胶原诱导的关节炎及过敏性气道疾病等的发病过程中具有重要作用［7-9］。但目前国内关于IL-35 与毛细支气管炎关系的研究报道较少。本研究观察了毛细支气管炎患儿血清IL-35及Th2类细胞因子的水平变化，探讨了血清IL-35及Th2 类细胞因子之间的关系，并分析了二者对毛细支气管炎病情严重程度的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取蚌埠医学院第一附属医院2019年12月—2021年3月收治的诊断为毛细支气管炎的患儿68 例。纳入标准：符合《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识（2014年版）》［1］中毛细支气管炎的诊断标准。排除标准：①先天性气道发育畸形、先天性心脏病、免疫缺陷病、哮喘等；②合并细菌感染；③合并全身多系统、器官的损害；④近期使用免疫调节药物。根据《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识（2014年版）》［1］，将患儿分为轻度组34例及中重度组34例，对照组选取我院儿科康复病房同期同年龄，近期无呼吸道感染临床症状，无其他系统感染史的儿童（诊断为发育指标延迟、全面性发育落后等的儿童）。由于中、重度毛细支气管炎的诊断标准较为接近，且中、重度组病例数相对轻度组少，故将其合并为一组。观察组年龄中位数为7 个月，对照组年龄中位数为11个月，两组年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。轻度组年龄中位数为6 个月，入院时的病程中位数为4 天，中重度组年龄中位数为8.5个月，入院时的病程中位数为3.5天，两组年龄、入院时的病程差异均无统计学意义（P均＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准，患儿家属知情同意。

1.2 血清IL-35、Th2 类细胞因子的检测 患儿入院24 h 内，抽取空腹外周静脉血，静置半小时后，以3000 r/min 离心10 min，离心半径为10 cm，将血清分装在冻存管内，做好标记放入-20 ℃冰箱保存备用。采用ELISA 法检测血清中的IL-35 及Th2 类细胞因子，IL-35 试剂盒由Elabscience 公司生产，各Th2 类细胞因子试剂盒均由ABclonal 公司生产，操作严格按照说明书进行，反应终止后在ELISA 检测仪上，于450 nm 波长下，以空白对照孔调零后测各孔OD 值，用ELISA 数据分析软件计算对应样本浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk 检验进行正态性检验，并进行方差齐性分析，如果数据呈正态分布，用±s表示，比较采用t检验；如果数据呈非正态分布，用M（P25，P75）表示，比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料比较采用χ2检验。细胞因子间相关性分析采用Spearman 相关。影响因素分析采用多元线性回归。诊断效能分析采用ROC。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平比较 观察组血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平 分 别 为10.55（9.00，12.11）、（7.73 ± 1.39）、（129.15 ± 17.80）、（741.00 ± 109.87）、31.21（24.92，38.38） pg/mL，对 照 组 分 别 为14.34（12.48，16.81）、（5.46 ± 1.17）、（158.58 ± 17.14）、（569.12 ±96.91）、52.92（45.18，60.45）pg/mL。与对照组比较，观察组血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低，IL-4、IL-13水平高（P均＜0.01）。

中重度组血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平 分 别 为（9.65 ± 1.74）、8.45（7.49，9.71）、（121.49 ± 17.26、（788.00 ± 95.80）、（29.21 ±7.75）pg/mL，轻度组分别为（11.52 ± 1.90）、6.93（6.29，7.45）、（136.80 ± 14.99）、（694.00 ± 103.81）、（34.09 ± 8.63）pg/mL。与轻度组比较，中重度组血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低（P均＜0.05），IL-4、IL-13水平高（P均＜0.01）。

2.2 观察组血清IL-35与TH2类细胞因子之间及二者与病情之间的关系 血清IL-35与IL-10呈正相关（rs=0.291，P＜0.05），与IL-4 呈负相关（rs=-0.251，P＜0.05）。

以中重度毛细支气管炎为因变量（是=1，否=0），以IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35为自变量（均以实际值赋值）进行回归分析。结果显示，IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 是疾病严重程度的影响因素（P均＜0.05）。见表1。

表1 观察组疾病严重程度的多元线性回归分析结果

2.3 血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 对中重度毛细支气管炎的诊断效能 IL-35 的诊断界值为10.53 pg/mL，曲线下面积（AUC）为0.760（95%CI：0.641～0.855，P＜0.001），灵敏度为70.6%，特异度为70.6%；IL-4 的诊断界值为7.3 pg/mL，AUC 为0.827（95%CI：0.716～0.908，P＜0.001），灵敏度为82.4%，特异度为73.5%；IL-10 的诊断界值为115.38 pg/mL，AUC 为0.712（95%CI： 0.589～0.815，P＜0.001），灵 敏 度 为44.1%，特 异 度 为97.1%；IL-13 的 诊 断 界 值 为643 pg/mL，AUC 为0.739（95%CI：0.618～0.838，P＜0.001），灵敏度为97.1%，特异度为41.2%；IL-33 的诊断界值为22.61 pg/mL，AUC 为0.635 （95%CI： 0.509～0.748，P＜0.05），灵 敏 度 为26.5%，特 异 度 为100.0%，详见图1。

图1 血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33诊断中重度毛细支气管炎的ROC

3 讨论

随着近年来毛细支气管炎发病率的上升，疾病免疫学方面的研究逐渐增多。研究认为，毛细支气管炎的发病过程与免疫反应密切相关，Th1/Th2 免疫失衡是毛细支气管炎的主要发病机制之一，主要表现为Th2 型免疫反应增强，Th1 型免疫反应减弱［3］。针对相关细胞因子的研究对诊断及治疗毛细支气管炎具有重要意义。

IL-35 主要由Tregs 细胞产生，IL-35 在T 细胞上有3 种受体，包括IL-12Rβ2同型二聚体、gp130 同型二聚体及IL-12Rβ2/gp130 异二聚体，IL-35 通过与T细胞上的受体结合，激活JAK1、JAK2、STAT1 及STAT4 信号转导通路，发挥生物学效应［6］。IL-35 可通过抑制细胞分裂G1期向S 期分化，抑制CD4+、CD8+T 细胞（Th1、Th17 等）的增殖，抑制Th1 类细胞因子及IL-17A 的分泌［10］；可通过抑制GATA3 和IL-4的表达，抑制Th2 的增殖，抑制Th2 型免疫反应［11］。本研究发现，毛细支气管炎患儿血清IL-35 水平低，且中重度患儿较轻度患儿更明显，提示IL-35在毛细支气管炎中可能具有保护作用。通过研究细胞因子间相关性发现，IL-35与IL-10呈正相关，与IL-4呈正相关。ROC显示，IL-35对中重度毛细支气管炎具有较高的诊断效能，提示IL-35可用于辅助判断毛细支气管炎的严重程度。FAN 等［12］的研究发现，RSV 感染组患儿IL-35的水平较健康对照组升高。IL-35的水平变化存在争议。有证据表明，IL-10在RSV感染不同阶段中的表达有差异［13］，且IL-35 与IL-10 存在相关性［12］，因此，IL-35 可能存在类似的变化。廖廷彦等［14］的研究发现，RSV 感染的毛细支气管炎患儿入院后第2 天血清IL-35 的水平低于对照组，本研究的结果与其一致，说明IL-35 在RSV 感染不同阶段中的表达存在差异，可能是不同研究中IL-35水平差异产生的原因。

Th2 类细胞因子IL-4 是Th2 型免疫反应的特征性细胞因子，可抑制Th1 类细胞因子IFN-γ 的活性［3］。IL-10 由CD4+及CD8+T 细胞产生，参与RSV激活的免疫细胞产生的促炎细胞因子和趋化因子的调节。在毛细支气管炎中，IL-10缺乏可引起疾病严重程度增加，恢复延迟［13］。IL-13在哮喘的发病过程中具有重要作用，可促进IgE 的产生［15］。在呼吸道疾病中，IL-33 是哮喘等过敏性气道疾病的重要介质。IL-33 主要由组织细胞表达，包括上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞，在炎症感染时可由肥大细胞及树突样细胞表达［16］。IL-33 受体包括ST2 蛋白及IL-1 受体辅助蛋白，IL-33 与受体结合，通过MyD88、MAPK 及NF-κB 蛋白转导信号，参与机体的先天性免疫及适应性免疫［15-16］。当感染或组织损伤时，IL-33从坏死的细胞核释放到细胞外，促使2 型先天性淋巴细胞（ILC2s）刺激Th2类细胞因子IL-5、IL-13的分泌，免疫反应向Th2 偏移［17-18］。本研究发现，毛细支气管炎患儿血清IL-4、IL-13 水平高，IL-10、IL-33 水平低，且中重度患儿较轻度患儿更明显。多元回归分析显示IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 均是疾病严重程度的影响因素，提示Th2 类细胞因子与疾病严重程度相关。ROC 显示，IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 对中重度毛细支气管炎均具有较高的诊断效能，提示Th2类细胞因子可用于辅助判断毛细支气管炎的严重程度。FAN等［12］的研究发现，RSV感染组患儿IL-10的水平较健康对照组显著升高，中重度患儿血清IL-10的水平较轻度患儿显著降低。GAO 等［19］通过小鼠模型发现，RSV 感染小鼠的外周血Tregs 及IL-10 的水平低于健康小鼠。IL-10 的水平变化存在争议。SUN 等［13］的研究发现，在RSV 感染后的24 h 内，小鼠表现为细胞因子、趋化因子的表达增加，此时，IL-10 未诱导Th2 类细胞因子的产生，而在感染后的8～10 天，小鼠表现为Th2 类细胞因子的表达增加。在RSV 感染后的第6 天，IL-10 呈高表达，在第8 天，IL-10 的水平逐渐降低。因此，IL-10 在RSV 感染不同阶段中的表达差异可能是不同研究中IL-10 水平差异产生的原因。VU 等［17］研究发现，中重度RSV感染患儿的鼻咽分泌物IL-4、IL-13、IL-33 及ILC2s的水平较轻度患儿显著升高，多元回归分析显示IL-4（OR=9.67，95%CI：2.45～38.15，P=0.001）是疾病严重程度的影响因素。CHRISTIAANSEN 等［3］的研究发现，多数RSV 感染患儿Th1 及Th2 类细胞因子的水平升高，但IL-33 及Tregs 的水平降低。IL-33 的水平变化存在争议。CHRISTIAANSEN 等［3］认为，RSV感染时细胞凋亡而非坏死可能是IL-33水平变化的原因，IL-33 的降低使Tregs 募集减少，引起Tregs的水平降低，但该推论仍有待进一步证实。

综上所述，毛细支气管炎患儿血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低，IL-4、IL-13 水平高，且中重度患儿较轻度患儿更明显。血清IL-35水平与IL-10呈正相关，与IL-4 呈负相关。Th2 类细胞因子是毛细支气管炎疾病严重程度的影响因素。IL-35 及Th2 类细胞因子可用于辅助判断毛细支气管炎的严重程度。随着对毛细支气管炎发病机制的研究，免疫治疗的重要性越发突出，针对相关细胞因子开发潜在的免疫治疗药物，对缓解毛细支气管炎的症状，缩短病程具有重要意义。本研究在设计上仍然存在一些缺陷。例如：患儿病原体的检出率较低，未能对引起毛细支气管炎的病原体进行具体划分，无法验证不同病原体对细胞因子水平的影响；患儿的年龄范围较广，未再进行准确分类，无法验证年龄对细胞因子水平的影响；针对患儿血清进行研究较呼吸道分泌物准确性差。以上均有可能对研究结果产生影响。下一步研究将筛选RSV 感染的毛细支气管炎患儿，观察疾病不同阶段血清IL-35 及Th2 类细胞因子的变化，探讨IL-35及Th2类细胞因子在疾病各阶段的作用。