氟伐他汀对高糖环境中培养的原代人脐静脉内皮细胞损伤改善作用及其机制

雷永芳，林敏华，汪余嘉，聂雪坤，林小惠，陈子春

宁德师范学院附属宁德市医院临床药学室，福建 宁德 352100

糖尿病已成为继肿瘤与心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病［1］。该病引发的微血管及大血管并发症，可造成患者中风、截肢、失明甚至死亡等严重不良后果［2-3］。研究提出，内皮功能障碍是糖尿病患者诱发并加重糖尿病血管病变的重要危险因素，可独立预测心血管疾病风险［4］。FORSTERMANN等［5］研究提出氧化应激是诱发糖尿病并发症主要因素之一，持续的氧化应激可促进血管内皮功能障碍的发展［6］。据报道，Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶（SIRT1）是代谢性疾病的关键因子，对调控细胞内氧化应激、衰老及凋亡等起重要作用［7-8］。上调SIRT1 可有效防御高糖引起的氧化应激反应，消除高糖引起的内皮细胞损伤。因此，SIRT1 可能具有抵抗高糖诱导血管内皮功能障碍的作用，激活SIRT1 相关信号通路有望成为糖尿病血管并发症的重要防治策略。研究显示，他汀类药物除调脂功能还具有如抑制血小板功能、减轻炎症及氧化应激等多效性作用［9-10］。其中，氟伐他汀（Flu）是第一个具有抗氧化活性的全合成他汀，在改善糖尿病诱导血管内皮氧化损伤方面具有潜在的临床作用。糖尿病及血管内皮损伤作为动脉粥样硬化的前驱因素，在疾病发展过程中存在较多交叉机制［11-12］。研究提出，SIRT1 在他汀对冠状动脉粥样硬化性心血管的保护作用中起重要作用［13］，但SIRT1 在他汀对糖尿病血管疾病中的作用机制却尚未完全阐明。2020年6月—2021年5月，本研究以人脐静脉内皮细胞为实验对象，观察Flu 对高糖环境培养的血管内皮细胞活力及氧化应激的影响，并分析SIRT1在Flu改善高糖诱导血管内皮损伤中的作用，为他汀类药物防治糖尿病血管病变提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人脐静脉内皮细胞从宁德市医院产科健康足月孕妇计划性剖腹产所剥离胎盘上的脐带中分离培养所得，该研究方案经医院伦理委员会审批通过。ECM 培养基，购自美国ScienCell公司；Flu、葡萄糖粉末，购自美国Sigma 公司；Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔、DAPI，购自上海碧云天；MTS试剂盒，购自美国Promega公司；活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）试剂盒，均购自南京建成生物工程公司；血管性血友病因子（VWF）购自美国Cell Signaling Technology 公司；SIRT1、叉头框转录因子O1（FOXO1）、SOD2 mRNA 引物，均购自上海生工生物工程公司；逆转录试剂、染料法PCR 试剂盒，购自美国Promega 公司。CO2细胞培养箱购自美国ThermoFisher Scientific 公司；超净工作台购自上海Heal Force公司；超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus 公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；酶标仪购自美国Molecular Devices 公司；荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 人脐静脉内皮细胞的培养及Flu 的给予方法人脐静脉内皮细胞用含10% FBS 的ECM 培养基于37 ℃、5%CO2培养箱培养，培养至3～5 代可开始构建模型。首先将人脐静脉内皮细胞随机分组，各组细胞在处理前均用不含FBS 的ECM 培养基饥饿处理24 h。Flu + 高糖组分别在含30.5 mmol/L葡萄糖培 养 基 中 加 入0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 干预12 h；高糖组用含30.5 mmol/L葡萄糖培养基培养24 h；Flu组在常规培养的基础上加入0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 干预12 h；对照组常规培养。

1.3 各组人脐静脉内皮细胞活力检测 采用MTS法。各组细胞接种于96 孔板中，贴壁培养，加入20 μL MTS，培养箱中避光孵育2 h。酶标仪预热30 min，波长设为490 nm 测定吸光度值（A）。细胞活力=（A 给药-A 空白）÷（A 对照-A 空白）×100%。根据细胞活力值，后续实验中Flu + 高糖组中Flu 的浓度选定0.25、0.5、1.0 μmol/L。

1.4 各组人脐静脉内皮细胞中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH 检测 ROS 检测采用流式细胞术。收集各组细胞并加入1 mL 荧光探针DCFH-DA，培养箱中孵育30 min。无血清培养基清洗，消化收集细胞沉淀。500 μL PBS 吹打均匀，流式细胞仪检测各组细胞内的荧光强度，ROS水平以给药组荧光度/对照组荧光度表示。

MDA、SOD、CAT、GSH 检测采用化学比色法。收集各组细胞，1000 g 离心10 min，弃上清，留细胞沉淀。加入200 μL PBS 轻轻混匀，采用超声破碎仪处理，收集各组细胞破碎混悬液。按照MDA、SOD、CAT、GSH 试剂盒说明书分别处理细胞破碎液，依次加入各组试剂及显色剂，处理的各组混合液取200 μL置于96孔板中。酶标仪测定各孔OD值。

1.5 各组人脐静脉内皮细胞中SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA 检测 采用RT-PCR 法。 收集各组细胞，TRIzol 提取细胞中总RNA。分光光度计检测RNA 浓度，按说明书在RNA 中加入逆转录试剂，PCR 仪反转录合成cDNA，再采用实时定量PCR 仪扩增。根据试剂盒要求设置PCR 条件：95 ℃、2 min预变性，热循环95 ℃、15 s，退火温度50～60 ℃（根据引物情况设置：SIRT1 为50 ℃；FOXO1 为53 ℃；SOD2 与ACTB 为60 ℃），时间均为60 s，40 个循环。ACTB 引物生工提供；SIRT1 上游引物序列为5’ACTGTGAAGCTGTACGAGG3’，下游引物序列为5’CTGAAACATGAAGAGGTGTG3’；FOXO1 上游引物序列为5’AAACACCAGTTTGAATTCACCC3’，下游引物序列为5’TCGACTTATTGTCCTGAAGTGT3’；SOD2 上游引物序列为5’GGCTTTGGGGTATCTGGGCT3’，下游引物序列为5’TGGTACTTCTCCTCGGTGACGTT3’。每组3 个复孔，以ACTB 为内参，根据2－ΔΔCt公式计算目的基因mRNA相对表达情况。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。采用Shapiro-Wilk方法进行正态分布检验，符合正态分布的计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。方差齐性检验采用F检验评估。当方差齐时，LSD 检验比较组间差异；方差不齐时，Games-Howell 检验比较组间差异。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人脐静脉内皮细胞活力比较 Flu组加入0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 后，细胞活力分别为99.52% ± 7.84%、98.62% ± 1.73%、100.29% ± 1.80%、101.40% ± 4.50%、102.83% ±6.02%、105.78% ± 4.38%，对照组为100%，Flu组与对照组比较，P均＞0.05。 高糖组细胞活力为72.80% ± 1.37%。Flu + 高糖组加入0、0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 后细胞活力分别为72.80% ± 0.69%、73.01% ± 0.85%、72.22% ±0.95%、75.67% ± 1.87%、85.46% ± 1.60%、89.55% ± 2.01%、99.04% ± 2.81%，0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L Flu 各组相比高糖组细胞活力明显提高（P均＜0.05）。

2.2 各组人脐静脉内皮细胞内ROS、MDA、SOD、CAT、GSH 水平的比较 与对照组比较 高糖组ROS、MDA、GSH 水平升高，SOD、CAT 水平降低（P均＜0.05）。 与 高 糖 组 比 较，Flu + 高 糖 组 加 入0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L Flu后细胞内ROS 水平降低（P＜0.05）；加入1.0 μmol/L Flu 后细胞内MDA、GSH 水平降低，SOD 与CAT 水平提高（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞内ROS、MDA、SOD、CAT、GSH水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与高糖组比较，#P＜0.05。

组别Flu + 高糖组0.25 μmol/L Flu 0.5 μmol/L Flu 1.0 μmol/L Flu高糖组对照组ROS 1.73 ± 0.12#1.08 ± 0.07#1.12 ± 0.03#2.31 ± 0.04*1.00 MDA（nmol/mg·prot）3.42 ± 0.203.67 ± 0.312.28 ± 0.01#3.71 ± 0.05*2.01 ± 0.23 SOD（U/mg·prot）32.31 ± 0.3738.19 ± 1.82#36.41 ± 0.95#31.63 ± 1.46*38.44 ± 1.65 CAT（U/mg·prot）14.31 ± 0.1719.81 ± 0.53#17.91 ± 0.76#14.52 ± 0.21*21.62 ± 0.48 GSH（μmol/mg·prot）70.31 ± 4.68#52.70 ± 3.20#42.87 ± 0.63#96.19 ± 3.77*69.46 ± 3.43

2.3 各组人脐静脉内皮细胞内SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA相对表达量比较 与对照组比较，高糖组中SIRT1、SOD2 mRNA 相对表达量下降（P均＜0.05）；与高糖组比较，Flu + 高糖组加入1.0 μmol/L Flu 后SIRT1、SOD2 mRNA 相对表达量升高（P均＜0.05）。各组FOXO1 mRNA 相对表达量比较，P均＞0.05。见表2。

表2 各组SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA 相对表达量比较（±s）

表2 各组SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA 相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与高糖组比较，#P＜0.05。

组别Flu + 高糖组0.25 μmol/LFlu 0.5 μmol/L Flu 1.0 μmol/L Flu高糖组对照组SIRT1 mRNA 0.78 ± 0.221.30 ± 0.252.46 ± 0.54#0.70 ± 0.09*1.00 FOXO1 mRNA 1.00 ± 0.131.00 ± 0.121.26 ± 0.130.93 ± 0.021.00 SOD2 mRNA 1.10 ± 0.301.26 ± 0.11#1.42 ± 0.14#0.82 ± 0.04*1.00

3 讨论

2 型糖尿病发病率逐年增高，且并发症较多。其中，血管并发症是最常见疾病之一，也是2型糖尿病患者的主要致死原因［14］。研究发现，高血糖诱发的内皮功能障碍是糖尿病心血管事件的主导因素，但机制不明。本研究拟深入研究高血糖诱导血管内皮功能障碍的作用机制，探索有效的治疗药物，为防治上述疾病提供理论依据。

血管内皮是存在于血管壁与血流之间的一层保护屏障，由单层的内皮细胞构成［15］。本研究从人脐静脉中分离获取原代血管内皮细胞，并利用免疫荧光化学法鉴定血管内皮细胞的生物标志因子VWF。结果显示，VWF 在分离培养的细胞中表达显著，提示分离细胞为人脐静脉内皮细胞。

Flu为经典的调脂药物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用［16-17］。前期研究显示，Flu 对波动高糖诱导的血管内皮损伤具有保护作用［18］。同时有报道指出0.01～0.1 μmol/L 的Flu 可阻止H2O2诱导的内皮细胞凋亡［19］。本研究将人脐静脉内皮细胞置于30.5 mmol/L 的高糖中培养，以构建糖尿病体外模型，结果发现高糖可显著降低人脐静脉内皮细胞活力，而0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L Flu可明显改善高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。

机体长期处于高血糖环境可产生过多ROS，且ROS 持续或过量产生，可氧化蛋白质、脂类和核酸，产生有毒衍生物，进而诱导血管内氧化应激反应，影响胰岛素分泌，加剧糖尿病血管病变［20-21］。本研究结果显示，与对照组比较，高糖组细胞中的ROS 水平升高；与高糖组比较，Flu + 高糖组加入0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 后细胞内ROS 水平降低，提示Flu可改善高糖诱导人脐静脉内皮细胞的氧化反应。MDA 可作为细胞内氧化应激的重要标志物，而抗氧化酶SOD、CAT、GSH 等是抵御氧化应激的重要生物酶［22］。上调抗氧化酶的表达可保护细胞免受ROS攻击，改善细胞内氧化应激状态。本研究结果表明，高糖处理人脐静脉内皮细胞可导致MDA、GSH 水平显著升高，同时SOD、CAT 水平明显下降；而Flu 干预后，可逆转高糖诱导的氧化应激状态。此外，本研究中GSH 异常表达可能是在高糖诱导的氧化效应下反应性升高，而Flu 干预后，GSH 也随之下降，与ALVES-FERNANDES 等［23］相关研究结果一致，提示Flu 可通过增强人脐静脉内皮细胞中的抗氧化防御机制，减轻高糖诱导的氧化损伤。

SIRT1 可调控转录因子与激活因子，如FOXO1、核因子-κB（NF-κB）及肿瘤抑制基因P53等，参与氧化应激、炎症及DNA 修复等过程［24-25］。上调SIRT1 可显著改善人脐静脉内皮细胞的氧化损伤，研究发现，在以高糖高脂构建的糖尿病小鼠中SIRT1 的表达明显下调［7］。XU 等［26］研究发现，激活SIRT1 可有效抵抗氧化诱导的内皮细胞衰老，并促进血管生成。本研究结果显示，Flu 可上调高糖中SIRT1 与SOD2 的mRNA 表达，但不影响FOXO1的mRNA 表达，这可能与SIRT1 对FOXO1 的去乙酰化调控作用相关。因此，推测Flu 可能通过调控SIRT1 相关信号通路增强人脐静脉内皮细胞抗氧化作用，对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤起保护作用。

综上，在高糖环境下，Flu 可能通过上调SIRT1表达从而提高抗氧化酶含量并降低ROS 水平，发挥提高人脐静脉内皮细胞细胞活力、抵抗氧化应激反应、改善高糖诱导的血管内皮功能障碍的作用。但是Flu 在高糖环境下调控SIRT1 的具体机制及对SIRT1/FOXO1/SOD 信号通路的影响仍需进一步探索。