基于多糖的高吸水率可吸收止血材料的研究

【作 者】吴昊，彭飞，王进

成都迪康中科生物医学材料有限公司，成都市，610000

0 引言

止血材料行业属于医疗器械的细分行业。近年来随着手术范围的不断扩大，其应用范围也日益广泛。据全国医药经济信息网的数据显示：我国每年临床治疗的手术病人超过 400万人次，主要集中在外科手术科室以及部分内科手术科室。随着我国外科手术水平和外科手术治疗覆盖率的提高，以及器官移植术的供不应求，止血类材料在临床已必不可少。

外科手术中，无一例外涉及出血与止血[1]。手术操作或创伤，特别是大的创面出血、渗血，有时很难控制，不但会导致失血量增大，而且还会增加手术难度，甚至危及生命，而良好的止血类材料是手术安全进行的前提和保障。因此，止血材料具有巨大的发展空间。

随着医学、生物工程学及材料学的发展，各种新型止血材料不断问世[2-4]。材料逐渐由不可吸收向可吸收方向转化，由动物源向植物源方向转化，由蛋白类逐渐向糖类的转化。可吸收止血材料产品种类繁多，目前上市产品主要有微纤维胶原[5]、医用止血明胶[6]、氰基丙烯酸类组织胶[7]、蛋白类止血材料[8]及多糖类止血材料[9]等，其在临床及日常生活中的应用极为广泛。比如美国Z-Medica公司生产的多孔沸石止血材料QuikClot[10]，但是该止血材料无法被人体降解，并且使用时在伤口处易发热对创口造成灼伤，极大地限制了其应用。纤维蛋白胶、医用止血明胶、微纤维胶原以及胶原纤维网等作为止血材料使用时也有较大的缺点，这些材料具有动物源性，可诱发患者发生过敏反应，存在较高的潜在使用风险。氰基丙烯酸类组织胶类止血材料在降解过程中释放出氰和甲醛等有毒物质，会引起炎症反应或伤口愈合延迟，存在较大的安全隐患[11]。而多糖类可吸收止血材料是自然界中大量存在的天然高分子材料具有来源丰富、价格低廉、生物相容性良好、在人体内易被降解吸收、不良反应少等诸多优势，因此成为当前止血材料的研究热点[12-14]。美国HemCon公司就基于壳聚糖研发出了一种止血绷带，止血效果良好，且无毒副作用。

我们旨在制备出一种具有优秀止血性能且安全有效的新型止血材料，本研究具备止血迅速、吸水率高、促进伤口愈合、可完全吸收降解及良好的生物相容性等特点。本研究使用盐酸对马铃薯淀粉进行酸解增加其表面积，交联成微球后极大地提升了吸水效率，并且通过表面改性羧甲基化进一步提升吸水率[15-17]。该研究中制备的止血微球粒径均一呈球形，体外α-淀粉酶环境下表现出优秀的降解速率，并且使用大鼠和家兔对体内安全性和止血有效性进行评价，本研究描述的止血材料，有望为临床与生活止血材料的研究开辟新的方向。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

马铃薯淀粉、盐酸、氢氧化钠、硼氢化钠和氯乙酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙醇、大豆油、环氧氯丙烷和Span80购自成都市科隆化学品有限公司，所有试剂均为AR级，纯化水为自制。

使用仪器以及SD大鼠和新西兰兔均为成都里来生物医学中心提供。使用扫描仪包括：扫描电子显微镜（SU3500型）、核磁共振谱仪（AVANCE III 500 MHz）、傅里叶红外光谱仪、鼓风干燥箱、恒温水浴锅、机械搅拌器、光学显微镜MCL-1600、紫外分光光度计、匀浆仪、布氏漏斗。

1.2 止血材料制备

1.2.1 酸解

将马铃薯淀粉原料通过乙醇清洗3次，鼓风干燥箱70oC烘干24 h。配制300 mL浓度6%的盐酸水溶液，准确称取清洗烘干后的马铃薯淀粉100 g加入至上述盐酸水溶液中45oC搅拌2 h，2 h后使用布氏漏斗抽滤产物，纯化水和乙醇各清洗3次，鼓风干燥箱60oC烘干24 h。

1.2.2 交联

准确称取10 g酸解马铃薯淀粉和0.2 g氢氧化钠，加入至40 mL纯化水中，称取0.2 g硼氢化钠，加入到上述淀粉溶液中搅拌30 min，30 min后加入3 g Span80和80 mL大豆油继续搅拌30 min，30 min后向乳液中加入6 mL环氧氯丙烷，加入后在50oC条件下搅拌4 h。反应完成后加入1 000 mL纯化水破乳，转移至分液漏斗中过夜分层，取下层水相，抽滤后使用乙醇回收干粉颗粒，鼓风干燥箱70oC烘干24 h，得到白色粉末状产物。

1.2.3 醚化

准确称量20 mL纯化水和180 mL无水乙醇混合均匀，称取5 g氢氧化钠溶于上述溶液中。准确称取5 g上一步交联后的马铃薯淀粉，倒入上述溶液中在50℃条件下搅拌1 h，1 h后准确称取5 g氯乙酸倒入上述淀粉溶液，并继续在50oC条件下搅拌4 h，4 h后将使用布氏漏斗抽滤，并使用乙醇反复抽洗至pH值到6.0～8.0，80oC烘干得白色粉末产物。

2 结果与讨论

2.1 止血粉形貌表征

配置显色碘溶液（含0.33%碘和0.66%碘化钾）10 mL，取止血粉100 mg，并加入5 mol/L显色碘溶液，使其充分吸水染色，并在MCL-1600型光学显微镜（40×）下观察。通过显微镜配套软件保存成像图片。止血粉使用碘显溶液显色后在光学显微镜下的表征，如图1所示，从图中可以看出，止血粉吸水后呈球形，并且分布均匀，粒径较为均一。

图1 止血淀粉光学显微镜形貌图Fig.1 Optical microscope of hemostatic starch

使用扫描电子显微镜（SU3500型）观察干燥止血粉的微观形貌，如图2所示。从图中可以看出，止血粉表面不光滑，这是由于在制备过程中使用了酸解和醚化工艺，使得止血粉表面轻微酸解并接枝了羧甲基官能团，让止血粉表面比表面积增多，并使得止血粉具有更高的吸水倍率。

图2 止血粉SEM成像图Fig.2 SEM of hemostatic powder

2.2 止血粉结构表征

止血粉的化学结构使用红外光谱和核磁共振氢谱来表征。在红外表征中，分别称取1 g干燥止血粉，在傅里叶红外光谱仪（FTIR）下记录红外光谱。止血粉红外光谱谱图如图3所示，从图中可以看出，止血粉红外光谱在1 020 cm-1的P-O-C伸缩振动峰较强，证明止血粉是交联过的淀粉，同时1 603 cm-1和1 414 cm-1的振动峰证明止血粉为经过羧甲基改性后的淀粉。

图3 止血粉红外光谱谱图Fig.3 Spectrum of hemostatic Pink

在固体核磁表征中，分别称取2 g干燥止血粉、马铃薯淀粉和羧甲基淀粉钠，在核磁共振谱仪（AVANCE III 500 MHz）下测定止血粉的核磁共振氢谱（1H NMR）。

止血粉核磁谱图，如图4（a）所示，同时，使用马铃薯淀粉和羧甲基淀粉钠的核磁谱图如图4（b）、图4（c）所示，进行对比分析。通过对比止血粉、马铃薯淀粉、羧甲基淀粉钠核磁谱图可知，止血粉和羧甲基淀粉钠出峰区域都大致一样，可分为55～67 ppm、67～80 ppm、80～90 ppm、90～110 ppm、170～190 ppm五个区域，而除了170～190 ppm的出峰区域与普通马铃薯淀粉不一样外，其他区域都是一样的，可以推测177.08 ppm和178.75 ppm为官能团，结合核磁共振碳谱化学位移总览表，170～190 ppm该区域出峰都代表的正是，所以可以肯定推测是正确的，说明止血粉中含有羧基。通过羧甲基化的反应原理，因此羧甲基淀粉钠的化学式可以表达为：淀粉-OCH2COONa。

图4 三种材料的NMR 核磁谱图Fig.4 NMR spectrum of three kinds of materials

综上所述，止血粉在保持马铃薯淀粉特征峰的前提下，成功进行了交联改性，并通过羧甲基化成功在其表面接枝官能团-OCH2COONa。

2.3 止血粉吸水率表征

取5 g止血粉，平均分成5份，测试吸水率，测试方法如下：将抽滤纸润湿后进行抽滤得到质量m0的润湿滤纸，称取质量为m1的干燥止血淀粉。将止血粉倒入抽滤纸上，使用纯化水将其全部润洗后抽滤，直到没有水滴下落为止，这时候将滤纸和止血粉全部取出，称得其质量为m2。

通过以下公式计算出每克止血淀粉的吸水率：

测量3次后取平均值，0.5 g≤m1≤1.5 g。

止血粉和市售产品Arista的吸水率，如图5所示，5次测试止血粉吸水率均在800%以上，平均吸水率达到881.28%，市售产品Arista经测试吸水率812.3%，我们研究的止血粉平均吸水率略高于市售产品Arista。

图5 止血粉和市售产品Arista的吸水率Fig.5 Water absorption of hemostatic powder and commercial product Arista

2.4 止血粉止血效果

2.4.1 动物试验方案

动物试验分为A、B两组，其中A组为实验组，B组为对照组，使用对应试验样品。共90只大耳兔，术后1 d、3 d、7 d和14 d为观察点，各取5只大耳兔观察止血及术后恢复情况。

动物造模皮下出血模型：

（1）全部动物术前均禁食（不禁水）12 h，3%戊巴比妥钠30 mg/kg体质量腹腔注射麻醉；

（2）动物麻醉后仰卧位固定，将动物腹部剪毛并用碘尔康溶液消毒铺巾；

（3）无菌操作下取腹正中切口，长约4～5 cm。锐性刮除壁层腹膜及其下部分肌层，形成1 cm×1 cm的出血区域，对侧腹壁也按此法制造同样缺损；

（4）在损伤出血区域，实验组均匀喷涂止血淀粉0.3 g，对照组使用Arista产品0.3 g，并开始计时，直至出血停止，记录出血时间；

（5）止血完成后，将各试验组大耳兔以7号丝线关闭腹腔，动物术后监护，禁食12 h，单笼饲养；

（6）各受试组分别于手术后 1 d、3 d、7 d、14 d 麻醉处死5只，剖腹探查腹腔情况后采集标本进行分析。

2.4.2 止血时间分析

通过新西兰大耳兔皮下出血模型实验显示，并对照组B（Arista）止血粉相比，结果见表1。止血粉A组能够在更短的时间达到止血的效果，平均时间为138.7 s，比对照组B（Arista）快了15.6%的止血时间。与Arista止血粉对照组比较，我们研制的止血粉止血时间减少，有显著性差异（P＜0.05）。

表1 皮下出血模型止血时间分析Tab.1 Analysis of hemostatic time of subcutaneous hemorrhage

2.4.3 组织病理切片

止血粉在皮下止血后，观察动物在术后1 d～14 d天伤口部位的炎症反应，相关组织病理切片见图6～图9。从组织切片图中可以看出：

图6 1 d (×400) 皮下组织内中性粒细胞浸润Fig.6 1 d (×400) subcutaneous infiltration of neutrophils

3 d：皮下组织内结构被破坏，可见大量肌纤维变性或坏死，伴不同程度的纤维组织增生，可见明显的成纤维细胞增多；其中2例（2/5）可见少量中性粒细胞浸润，1例（1/5）可见少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润；其他未见明显病理变化。

图7 3 d (×400) 成纤维细胞增生Fig.7 3 d (×400) fibroblast proliferation

7 d：皮下组织内结构较为清晰，可见部分肌纤维变性或坏死，不同程度的纤维组织增生，可见明显的成纤维细胞增多；其中1例（1/5）皮下组织内中度水肿，1例（1/5）可见少量中性粒细胞浸润；其他未见明显病理变化。

图8 7 d (×400) 成纤维细胞增生Fig.8.7 d (×400) a large number of fibroblasts proliferated

图9 14 d (×400)皮下组织恢复完好Fig.9 14 d (×400) the subcutaneous tissue recovered

14 d：皮下组织内结构完整清晰，未见明显的肌纤维变性或坏死，其中1例（1/5）可见少量纤维组织增生；未见明显的炎细胞浸润；其他亦未见明显病理变化。

1 d：皮下组织内结构较为清晰，可见大量以中性粒细胞为主的炎细胞浸润，部分可见少量脓细胞，即变性坏死的中性粒细胞；其中2例（2/5）可见部分肌纤维变性坏死，偶见少量纤维组织增生，可见少量成纤维细胞；2例（2/5）皮下组织内中度水肿；其他未见明显病理变化。

组织切片结果显示，动物体内组织对止血粉无明显排异现象，并且在组织切片中，没有明显的止血粉材料残留，证明其在组织中已完全降解。在皮下出血模型中，组织炎症消退较快，具备良好的促进组织修复功能。

3 总结

本研究通过使用马铃薯淀粉作为原料，经过酸解、环氧氯丙烷交联和羧甲基醚化等步骤后制备出一种高吸水性的止血粉材料，通过对止血粉材料进行物化表征，确定化学结构和形貌。通过止血粉吸水性能的测试，结果显示平均吸水率略高于进口对照品。最后，通过皮下出血模型对止血粉止血效果进行评价，止血速度明显好于对照品，组织切片结果显示止血粉具有良好的生物相容性。本研究中的止血粉止血迅速、吸水率高、促进伤口愈合、可完全吸收降解并具有良好的生物相容性，为今后可吸收植入止血材料的开发提供了一条新的研究途径。