牙龈卟啉单胞菌上调钙结合蛋白1促进牙龈上皮细胞增殖

张雨薇 何雨轩 丁一 刘程程

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙周病科，成都610041

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）约占口腔癌的90%[1]。吸烟、酒精和病毒感染（如人乳头瘤病毒）是OSCC的独立危险因素[2-3]，但仍有15%的病例病因不明[4]。近年来，牙周致病菌被认定为OSCC的一个独立危险因素[3]。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周关键致病菌。Katz等[5]研究发现，P.gingivalis在口腔鳞状细胞癌组织中的检出量显著高于正常牙龈组织。P.gingivalis能够促进牙龈上皮细胞增殖，抑制凋亡，并诱导上皮—间充质转化，促进肿瘤的发生、发展[6]。细胞增殖是细胞通过分裂，使细胞数目增多，并将遗传信息传给子代细胞，细胞过度增殖则会导致恶性肿瘤。因此，探究P.gingivalis促进牙龈上皮细胞增殖的机制具有重要意义。

钙结合蛋白1（calbindin 1，CALB1）和钙结合蛋白2（calbindin 2，CALB2）同是EF-手型家族的钙结合蛋白[7]。CALB1在谷氨酸受体激活后可调节钙离子内流，在正常骨细胞、成骨细胞和多巴胺能神经元[8-10]以及骨肉瘤细胞U2OS、非小细胞肺癌细胞和卵巢癌细胞等肿瘤细胞[11-13]中抑制多种促凋亡信号通路诱导的细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，常用于测定细胞凋亡[14]。CALB1能够调节肿瘤抑制蛋白p53。在卵巢癌细胞中，CALB1可作用MDM2，促进p53与MDM2的相互作用，导致p53蛋白降解[12]。p53蛋白水平及其转录活性受到MDM2调控，而MDM2的基因表达受到p53调控，形成负反馈通路[15]。目前P.gingivalis对CALB1表达的影响尚无报道。CALB2首次在视网膜中被发现，由视网膜神经节细胞亚群、暗斑和水平细胞表达[16]。CALB2在皮肤表皮细胞和皮肤腺上皮表达，并受到甲状腺激素紊乱的显著影响[17]。成人Malassez上皮亚群中也有表达，是成釉细胞瘤上皮、子宫内膜间质细胞和间皮细胞标志物[18-21]。本研究用CA9-22细胞体外模拟牙龈上皮细胞，探究P.gingivalis感染对CA9-22中CALB1表达的影响，以及CALB1在P.gingivalis影响细胞增殖和细胞凋亡中的作用，并初步探讨其相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

P.gingivalisATCC 33277、P.gingivalisW83、戈登链球菌（Streptococcus gordonii,S.gordonii）DL1由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。CA9-22细胞株购买自商城北纳创联生物科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉汤培养基、脑心浸液培养基、高容量逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）试剂、Taqman探针（Thermo Fisher Scientific公司，美国），DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），CALB1抗体、MDM2抗体、p53抗体、GAPDH抗体（CST公司，美国），Trizol（Invitrogen公司，美国），RNAeasy plus试剂盒（Qiagen公司，德国），LipoJet转染试剂（SignaGen公司，美国），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）细胞增殖酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Ab‐cam公司，英国），细胞凋亡荧光底物（EnzChek公司，美国），RIPA缓冲液（Roche公司，美国），BCA蛋白定量试剂盒、电化学发光试剂（Invitro‐gen公司，美国）。

1.2 实验设计及分组

1）探究P.gingivalis感染对CA9-22细胞CAL-B1表达的影响。①P.gingivalis感染对CA9-22细胞CALB1、CALB2 mRNA表达的影响。实验分为未感染组、P.gingivalisATCC 33277感染组、P.gingivalisW83感染组、S.gordoniiDL1感染组，采用qPCR法检测CALB1、CALB2 mRNA表达。②P.gingivalis感染对CA9-22细胞CALB1蛋白表达的影响。实验分为对照组和P.gingivalisATCC 33277感染组[包括感染复数（multiplicity of infection，MOI）10、50、100三亚组]，采用免疫印迹法检测CALB1蛋白表达。③大肠杆菌LPS对CA9-22细胞CALB1表达的影响，实验分为未处理组和大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理组，采用qPCR法检测CALB1 mRNA表达。

2）探究CALB1基因对P.gingivalisATCC 33277感染时CA9-22细胞增殖和凋亡的影响。细胞增殖实验分为未感染siRNA-Con组（未感染+siRNA沉默空白基因）、P.gingivalis感染siRNA-Con组（P.gingivalis感染+siRNA沉默空白基因）、未感染si-RNA-CALB1组（未感染+siRNA沉默CALB1基因）、P.gingivalis感染siRNA-CALB1组（P.gingivalis感染+siRNA沉默CALB1基因），采用BrdU进行细胞增殖分析。细胞凋亡实验时分为未感染组、P.gingivalis感染组、P.gingivalis感染siRNA-Con组、P.gingivalis感染siRNA-CALB1组，采用Cas‐pase-3活性测定法分析细胞凋亡情况。

3）探究CALB1基因对MDM2和p53蛋白表达的影响。实验分为未感染siRNA-Con组、P.gingivalis感染siRNA-Con组、未感染siRNA-CALB1组、P.gingivalis感染siRNA-CALB1组，其中P.gingivalis感染组中均为P.gingivalisATCC 33277感染。采用免疫印迹法检测MDM2、p53蛋白表达。

1.3 细菌和细胞培养

P.gingivalis培养在胰蛋白胨大豆肉汤培养基补充酵母提取物（1 mg·mL-1）、氯高铁血红素（5μg·mL-1）和维生素K（1μg·mL-1）中，37℃厌氧培养；S.gordonii培养在脑心浸液培养基中，37℃厌氧培养。

使用含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，将CA9-22细胞培养于5%CO2、37℃恒温条件下。隔日换液，2～3 d后使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM终止消化并离心后，重悬接种于培养皿中进行细胞传代。

将细胞培养至约80%时，采用MOI 10、50、100的细菌刺激1 h，然后更换新鲜DMEM培养基继续培养23 h，收集细胞用于实验[22]。

1.4 qPCR

Trizol法提取细胞总RNA后，进一步采用RNAeasy plus试剂盒纯化RNA。使用高容量逆转录试剂盒将RNA（2μg）反转录为cDNA后进行qPCR。将加好样品的96孔板放在ABI Stepone Plus型荧光定量PCR仪进行反应。引物序列：CALB1上游5’-ATGGCAGAATCCCACCTGCA-3’，下游5’-CTAGTTATCCCCAGCACAGAG-3’；CALB2上游5’-CCTGCACCTGGCCGAGCTGACG-3’，下游5’-GCTGGAGCCCACGTGCTGCCTG-3’；GAPDH上游5’-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游5’-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3’。设置PCR循环条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃15 s，共40个循环。自动计算阈值，每个反应体系中荧光信号达到设定阈值经历的循环数为循环阈值（Ct）。使用2ΔΔCt法对CALB1和CALB2基因的表达进行相对定量分析。

1.5 RNA干扰

细胞生长到约60%时，通过Lipojet转染试剂将siRNA转染至CA9-22细胞，转染24 h后，更换细胞培养基并加入细菌刺激24 h。收集细胞，qPCR检测目标基因敲除情况。

1.6 免疫印迹法

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液冰上充分裂解细胞，低温离心后取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。配置12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳转膜后，使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭1 h后，分别加入CALB1、MDM2、p53及GAPDH兔抗人一抗，4℃过夜。TBST洗膜3次后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h再次TBST洗膜3次，电化学发光法（electrochemiluminescence，ECL）显色。

1.7 免疫荧光法

CA9-22细胞在腔室载玻片上生长至60%时，采用P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）刺激细胞24 h，磷酸盐缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透后，使用2%BSA封闭45 min，加入CALB1兔抗人一抗孵育1 h，洗涤后将样本分别与Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗和Texas Red™-X鬼笔环肽共孵育1 h，最后使用含DAPI染料的中性树脂封片。通过Leica SP8共聚焦显微镜对样本进行扫描，并采集图像。

1.8 BrdU细胞增殖分析

在P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）感染结束前2 h，用10µmol·L-1BrdU标记CA9-22细胞。磷酸盐缓冲液清洗2次后用70%乙醇固定细胞30 min，磷酸盐缓冲液再次清洗后进行染色。用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育细胞30 min，磷酸盐缓冲液清洗后用3,3',5,5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物室温避光孵育30 min。加入终止液，检测OD450nm。

1.9 Caspase-3活性测定

将1μg·mL-1喜树碱（camptothecin，CAM）加入CA9-22细胞培养液中诱导细胞凋亡4 h。P.gingivalis感染组加入P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）培养24 h，收集、裂解细胞后，通过Enz-Chek Caspase-3分析试剂盒检测Caspase-3活性。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism V8软件对数据进行ANOVA和Tukey多重比较检验。

2 结果

2.1 P.gingivalis感染促进CA9-22细胞CALB1的表达

qPCR实验结果显示，与未感染组相比，P.gingivalisATCC 33277感染组和P.gingivalisW83感染组CA9-22细胞中CALB1表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；S.gordoniiDL1感染组CALB1表达无明显变化。与未感染组相比，P.gingivalis感染组和S.gordonii感染组CA9-22细胞中CALB2表达均无明显变化（图1A）。与未处理组相比，大肠杆菌LPS处理组CA9-22细胞中CALB1表达升高（图1B）。

图1 qPCR检测CA9-22细胞中CALB1和CALB2的表达Fig 1 Detecting the expression of CALB1 and CALB2 in CA9-22 cells by qPCR

免疫印迹法检测CA9-22细胞中CALB1蛋白表达结果显示，与对照组相比，P.gingivalisATCC 33277感染组CA9-22细胞中CALB1表达升高，各条带呈MOI依赖性（图2A、B）。免疫荧光检测显示，P.gingivalisATCC 33277感染组中CALB1蛋白荧光较对照组更明显（图2C）。

图2 CA9-22细胞中CALB1蛋白表达Fig 2 Expressionsof CALB1 in CA9-22 cells

2.2 CALB1影响P.gingivalis诱导的CA9-22细胞增殖

BrdU实验结果见图3A。与未感染siRNA-Con组相比，P.gingivalis感染siRNA-Con组的吸光度值增加；与未感染siRNA-CALB1组相比，P.gin-givalis感染siRNA-Con组的吸光度值无明显变化。可见，P.gingivalisATCC 33277感染促进了CA9-22细胞增殖，而降低CALB1的表达后可抑制P.gingivalisATCC 33277对CA9-22细胞增殖的促进作用。

图3 CALB1基因对P.gingivalis感染时CA9-22细胞增殖和凋亡的影响Fig 3 The effects of CALB1 on proliferation and apoptosis of CA9-22 infected with P.gingivalis

细胞凋亡实验结果见图3B。与未感染组相比，P.gingivalis感染组，P.gingivalis感染siRNA-Con组和P.gingivalis感染siRNA-CALB1组中CA9-22细胞Caspase 3活性均明显降低（P<0.00 1）；与P.gingivalis感染siRNA-Con组相比，P.gingivalis感染siRNA-CALB1组CA9-22细胞Caspase 3活性无明显变化。可见，下调CALB1表达不影响P.gingivalis感染对CA9-22凋亡的抑制作用。

2.3 CALB1通过MDM2-p53途径调控细胞增殖

免疫印迹法和蛋白表达定量分析检测结果见图4。与未感染组相比，P.gingivalis感染后CA9-22细胞MDM2表达升高，p53表达降低。与P.gingivalis感染siRNA-Con组相比，P.gingivalis感染siRNA-CALB1组CA9-22细胞MDM2表达降低，p53表达升高。

图4 CALB1对CA9-22细胞中MDM2和p53表达的影响Fig 4 Theeffectsof CALB1 on the expression of MDM2 and p53 in CA9-22

3 讨论

P.gingivalis是牙周关键致病菌，可内化于上皮细胞，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导上皮—间充质转化，引发细胞异常迁移，被认为是P.gingivalis引起上皮细胞功能紊乱的重要原因[6]。钙结合蛋白是一种对钙离子有高度亲和性的蛋白质，通过钙离子信号传导，调控细胞活动[23]。本课题从qPCR、免疫印迹、免疫荧光和RNA干扰等多个角度进行研究，结果表明P.gingivalis感染可导致CA9-22细胞CALB1表达显著增加，而降低CALB1的表达，可以显著抑制P.gingivalis诱导的细胞增殖，其机制可能与MDM2-p53途径有关。

钙结合蛋白作为细胞第二信使系统的重要成分，参与调控细胞增殖和细胞凋亡等多种细胞活动。研究[13]表明，CALB1表达下调后，骨肉瘤U2OS细胞增殖被显著抑制，细胞凋亡被促进。本研究发现，P.gingivalis感染对CA9-22细胞中CALB2的表达无显著影响，但可导致CALB1表达显著上调，并促进细胞增殖。降低CALB1表达会显著抑制P.gingivalis诱导的细胞增殖。这表明CALB1在P.gingivalis促进CA9-22细胞增殖过程中发挥重要作用。在细胞凋亡方面，本研究发现，P.gingivalis可以抑制CAM诱导的CA9-22凋亡，但下调CALB1表达对CA9-22细胞凋亡无显著影响，这提示P.gingivalis对CA9-22细胞凋亡的抑制作用不依赖于CALB1。

肿瘤抑制蛋白p53参与细胞增殖、代谢、衰老和凋亡等过程的大量基因的主转录调节因子，在预防细胞恶变中发挥重要作用。P.gingivalis的LPS可异常调节p53，并通过影响其下游炎性基因的表达，促进细胞增殖[24]。P.gingivalis的FimA菌毛蛋白可以降低p53水平，加速原代牙龈上皮细胞的细胞周期进展，促进细胞增殖[25]。p53的稳定性和活性受CHK2、Aurora A、CK1δ、CK1ε等激酶的影响。在P.gingivalis感染的牙龈上皮细胞中，这些激酶被抑制，进而影响P53的活性[26-27]。由此可见，P.gingivalis可以通过调节p53促进细胞增殖。MDM2不仅可与p53的反式激活结构域结合抑制p53[28]，也可以通过E3泛素连接酶的作用，将p53经泛素途径降解[12]。Cao等[12]通过蛋白质体外结合实验研究发现，在卵巢癌细胞中，CALB1可与内源性MDM2结合，促进MDM2和p53的相互作用，抑制p53。本研究免疫印迹法结果显示，P.gingivalis感染的CA9-22细胞中MDM2表达升高而p53表达降低；当降低CALB1表达后，MDM2表达降低，而p53表达升高，表明P.gingivalis感染促进CALB1表达，CALB1可能作为辅助激活因子通过影响MDM2-p53进而促进CA9-22细胞增殖。

综上所述，P.gingivalis可以通过上调CALB1的表达诱导CA9-22细胞增殖，其机制可能与MDM2-p53通路有关。本研究结果为P.gingivalis促进上皮功能紊乱机制的研究提供了新的靶点和思路。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。