间充质干细胞来源胞外囊泡在牙及颌面部组织再生中的研究与展望

廖立 田卫东

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔转化医学教育部工程研究中心 口腔再生医学国家地方联合工程实验室 四川大学华西口腔医院创伤整形外科，成都610041

感染、炎症、外伤、手术等多种因素均可导致口腔颌面部组织的缺损和缺失发生率高，严重损害患者身心健康。目前，牙髓坏死、牙周组织破坏、颌骨缺损和颌面部软组织缺损等是采用非生理性修复或生物材料替代，无法实现组织再生和生理结构的重建。为突破口腔颌面部组织再生修复面临的技术瓶颈，亟需寻求新的生物治疗策略。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是广泛分布于骨、脂肪、牙髓、牙周膜等结缔组织中的一类重要的成体干细胞，具有强大的自我更新和多向分化潜能，在局部组织发育、稳态维持、修复和再生中发挥关键作用[1]。MSCs能从体内获取并在体外进行扩增，目前已被应用于骨、软骨、皮肤、肌肉等多种组织的再生修复[1-2]。虽然基于MSCs的细胞治疗已在多种组织再生中取得显著的疗效，但制备困难、保存和运输、细胞异质性、长期体内存活引起的潜在风险和伦理问题等限制了其临床使用。目前干细胞治疗仍局限于缺乏有效治疗手段的危重病症，难以广泛推广。

研究证实，MSCs主要通过三条途径促进组织再生：1）直接分化为组织细胞；2）通过免疫调节功能改善局部再生微环境；3）通过释放多种生物活性成分，促进组织再生[1,3-4]。其中，MSCs的旁分泌作用越来越受到关注。研究者逐渐聚焦于解析MSCs分泌的关键生物活性成分，探索无细胞的治疗策略，以克服MSCs细胞治疗中面临的限制[5]。

最新研究[6]证实，胞外囊泡（extracellular vesi‐cles，EVs）是MSCs的重要分泌成分之一，在MSCs介导的多种组织修复再生中发挥关键作用。研究者们[6-7]广泛探索了MSCs分泌的EVs（MSCEVs）在骨、脂肪、心肌、神经及多种口腔组织再生中的作用，证明MSC-EVs是一类具有临床转化潜力的重要生物活性物质。与MSCs细胞治疗在应用上相比，MSC-EVs具有成分简单、作用途径明确、低免疫原性、致瘤风险低、易储存、可避免伦理问题等多种优势，且无需考虑细胞存活和异常分化等问题。据此，MSC-EVs可能成为一种全新的无细胞治疗手段用于组织再生，从而有效规避MSCs在应用上的限制，推动再生医学的进展。目前，全球已注册的EVs临床研究已超过200项，其中有2项应用EVs治疗口腔疾病的研究已开始招募志愿者。随着基础科学研究和产品应用开发的推动，EVs有望在组织再生、药物输送、免疫治疗和疾病诊断等领域得到广泛应用。因此，本文对近年来MSC-EVs在口腔组织再生中的基础研究及应用探索进行总结，并对MSC-EVs在转化应用中面临的问题展开讨论和展望，以期推动相关研究及转化应用。

1 MSC-EVs的定义、分类和基本成分

1.1 EVs的定义和分类

EVs是由细胞产生并分泌到细胞外的一类带有脂质膜结构的小囊泡。细胞分泌的EVs具有明显的异质性，根据产生机制的不同可分为外泌体（exosomes）、微囊泡（micro vesicles）和凋亡小体（apoptotic body）三类。其中，外泌体是通过膜内吞途径产生，粒径大小为40～200 nm，平均粒径在100 nm，表达四次跨膜蛋白超家族、Alix、tumor susceptibility 101（TSG101）等特异性的标志物。微囊泡是通过细胞膜向胞外而突出形成小泡，并释放入细胞外，粒径大小为200～2 000 nm，表达整合素、选择素、CD40等标志物。凋亡小体则是在细胞凋亡过程中通过胞膜皱缩内陷，分割包裹胞质而形成[8]。因为凋亡小体具有一定的特殊性，本文仅集中探讨MSCs分泌的外泌体及微囊泡。

因为其特有的产生方式，EVs含有丰富的蛋白、脂质、核酸（miRNA、mRNA、DNA）等生物活性物质[9]。更重要的是，释放入胞外的EVs可以通过表面特异的配体/受体结合或者非特异吸附的方式与靶细胞结合，通过胞吞作用、微胞饮作用、内吞作用等多种方式将其携带的物质运送入靶细胞内，调节靶细胞功能，从而发挥细胞间信息交流的作用[10]。

1.2 MSCs分泌丰富的EVs

研究证实，骨髓、脂肪、脐带以及牙髓、牙周膜、颌骨等组织来源的MSCs，均能够分泌数量丰富的外泌体和微囊泡。已有多项研究[11-12]对MSC-EVs的成分进行了系统性的检测，发现MSCs-EVs中含有多种生物活性物质，主要包括蛋白（转录因子、生长因子、细胞因子和酶等）、RNA（mRNA、siRNNA、miRNA等）、DNA（ss‐DNA、dsDNA等）和脂类（花生四烯酸、二十二碳六烯酸、磷脂酸、溶血卵磷脂等）。

因为其产生方式，MSC-EVs携带的物质与MSCs有一定程度的相似性，含有多种MSCs的特有成分和活性物质。通过比较MSCs和MSCs来源EVs中的蛋白质表达，发现在MSCs表达的总共6 342种蛋白中，有1 927种也表达于EVs[12]。而功能学研究也证明EVs的生物学活性往往与其来源的MSCs是相似的，同样具有促增殖、抗凋亡、促进血管形成和免疫调节等多种功能。

需要注意，不同组织来源和不同状态下MSCs分泌的EVs中的成分存在差异，可能导致其具有完全不同的生物学活性[13]。如牙髓来源MSC-EVs与骨髓来源MSC-EVs具有不同的免疫调节功能[14]；骨髓来源MSCs-EVs可促进干细胞向成骨方向分化，而脂肪来源的MSC-EVs更有利于干细胞向成脂方向分化[15]。也有研究[16]报告，骨质疏松患者来源的骨髓MSCs高表达miR-21，从而具有抑制骨再生的作用；而在肿瘤等疾病中，骨髓MSCs分泌的EVs成分会发生改变，并促进肿瘤形成[17]。因此，在本文中仅探讨健康组织来源的MSC-EVs。

2 MSC-EVs具有促进组织再生的功能

MSC-EVs可以被组织细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等多种细胞所摄取和吞噬，从多个途径影响组织再生修复的进程。这种多因素的协同作用，可能是MSC-EVs具有强大促组织再生能力的关键。

2.1 MSC-EVs促进组织细胞再生

2.1.1 细胞增殖功能 MSCs可以通过释放EVs调控局部组织细胞的增殖，从而维持组织稳态平衡和再生。研究[18]发现，在牙发育过程中，上皮与牙胚间充质细胞之间通过EVs相互传递重要的信号物质，调控细胞的有序扩增，从而实现牙的正常发育。体外研究[19]也发现，牙囊MSC-EVs可以促进炎症状态下牙周膜细胞的增殖，从而改善牙周炎状态下的牙槽骨修复再生。

2.1.2 细胞分化 已有多项研究[15]证实了MSC-EVs具有促进干细胞分化的作用。总体而言，MSCEVs的促分化功能与其来源细胞的谱系具有紧密联系。如骨髓来源MSCs-EVs可有效促进干细胞向成骨方向分化，脂肪来源MSCs-EVs可促进细胞向成脂方向分化。但也有研究[20]发现同种MSCs来源的EVs可以促进干细胞向不同的方向分化，可能与靶细胞的种类和细胞实验所使用的诱导条件有关。

2.1.3 细胞存活 MSC-EVs具有维持细胞存活、减少细胞凋亡的功能。在缺氧、炎症等病理条件下，MSC-EVs可通过维持组织细胞存活而促进组织再生。在心肌缺血、下肢缺血等动物模型中均观察到，使用MSC-EVs可以有效地预防和减少局部组织细胞的凋亡，从而加速组织再生过程。其作用可能是通过减少细胞内氧化应激等途径来实现[21]。

2.1.4 细胞迁移功能 多种组织来源的MSC-EVs均可以促进成纤维细胞的迁移，并且呈现出一定的剂量效应[22]。在皮肤创伤模型中，MSC-EVs通过加速局部细胞的迁移促进皮肤缺损愈合[23]。其作用途径是通过转运Wnt3α等细胞因子以及非编码RNA等，提高组织细胞的迁移能力[23]。

2.2 血管及神经再生作用

血管和神经再生是组织再生的必需环节。快速的血管再生和重建可以为组织细胞提供足够的氧气和营养支持；而神经再生可以通过神经分泌因子促进组织改建，并恢复组织器官感觉和运动功能。研究证明，EVs除直接促进局部组织细胞的再生修复外，可同时促进血管和神经再生，从而加速组织修复。如脂肪MSC-EVs通过转运miRNA（miR-125a等）促进血管内皮细胞介导的血管再生功能[24]；牙周膜MSC-EVs通过传递血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子促进血管再生[25]。骨髓MSC-EVs可以通过减轻氧化应激反应而保护神经元，减少神经系统损伤[26]。

2.3 免疫调节功能

局部的炎症和免疫反应对组织再生具有重要影响。EVs可以通过与免疫细胞表面直接结合或将内容物运输至免疫细胞内部的方式，调控T细胞、B细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞功能[27]。已有研究[28]发现MSC-EVs可促进初始T细胞向Th17和Treg细胞分化，并调控巨噬细胞的极化，使损伤局部的炎症细胞从发挥炎症促进作用转变为发挥炎症抑制作用，从而改善组织再生的微环境。

3 MSC-EVs在口腔组织再生中的应用研究

EVs具有强大的生物活性和多种作用途径，已被尝试用于多种疾病治疗[29]。此外，EVs可将多种活性分子携带入靶细胞内，转运效率高于脂质体等常规的药物载体，并且不易被免疫系统所清除，可作为理想的药物递送载体。目前，MSC-EVs已被用于口腔颌面部组织再生的临床前研究，并取得了较为理想的疗效，展现出广阔的应用前景。

3.1 牙髓再生

MSC-EVs可以通过直接促进牙髓干细胞/前体细胞的增殖分化和促进牙髓血管再生两条途径来共同加快牙髓再生。研究[30]发现，人根尖牙乳头MSC-EVs可促进牙髓局部的MSCs增殖和向成牙本质细胞分化，从而促进牙髓牙本质复合体的再生；同时，MSC-EVs可以促进牙髓中的内皮细胞的增殖、迁移以及促血管形成功能[31]。Huang等[32]研究发现，牙髓细胞来源的EVs通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路促进牙髓干细胞成骨分化；在体内异位移植试验中，牙髓细胞来源EVs可促进牙髓干细胞介导的牙髓再生[32]。本团队发现，除了MSC来源的EVs以外，人牙上皮细胞分泌的EVs也可调控人牙乳头细胞功能，通过激活Wnt通路促进人牙乳头细胞成牙分化而实现牙髓再生[19]。

3.2 牙周组织再生

牙周炎所致炎症微环境是导致局部干细胞功能异常和再生缺陷的关键。多项研究发现MSCEVs可以提高牙周炎组织中干细胞的成骨分化能力，减轻炎症对于局部干细胞的抑制作用。本团队研究[19]证实，牙囊干细胞来源EVs可促进炎症下牙周膜MSCs的增殖能力，并恢复其成骨分化和迁移能力。利用包载牙囊干细胞EVs的水凝胶，可有效治疗牙周炎所致颌骨缺损。此外，本团队还发现骨髓MSCs来源的EVs，可以通过调控骨保护素（osteoprotegerin，OPG）-核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB li‐gand，RANKL）-核因子κB受体活化因子（recep‐tor activator of nuclear factor-κB，RANK）信号通路抑制破骨细胞功能，并促进巨噬细胞由M1型向M2型的转化，从而缓解牙周炎所致的牙槽骨吸收[33]。

3.3 颌骨及软骨再生

MSC-EVs对于骨再生修复具有促进作用[34]。研究发现，骨髓间充质干细胞（bone marrow mes‐enchymal stem cells，BMSCs）来源的EVs与生物材料混合后移植可以促进骨缺损再生修复，其机制主要是通过上调骨诱导性miRNA（miR-22-3p、miR-381-3p、miR-146a-5p、miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p和Hsa-miR-129-5p）和下调骨抑制性miRNA（Hsa-miR-32-5p、Hsa-miR-133a-3p和Hsa-miR-204-5p），从而激活PI3K/Akt和MAPK等信号通路而发挥作用[35]。MSCs-EVs也可以通过转运长链非编码RNA而下调骨抑制性miRNA，间接促进成骨分化[36]。因为MSC-EVs同时具有促新骨形成和血管再生功能，有望应用于颌骨缺损修复和颌骨坏死的治疗[20]。

此外，MSC-EVs也具有促进软骨修复再生的功能。MSCs在成软骨分化过程中分泌的EVs，可以提高BMSCs的成软骨分化能力，可能用于软骨修复再生[37]。其机制可能是MSCs分化过程中产生的EVs携带有多种成软骨分化相关miRNA，从而进入受体细胞后可调控其成软骨分化[37]。有研究发现骨髓MSC-EVs可通过激活蛋白激酶B（pro‐tein kinase B，PKB），细胞外调节蛋白激酶（ex‐tracellular regulated protein kinases，ERK）及腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-acti‐vated protein kinase，AMPK）信号，抑制白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）造成的软骨破坏，促进关节软骨的修复和再生，从而可应用于颞下颌关节炎的治疗[38]。

3.4 颌面部软组织再生

颌面部皮肤、脂肪、黏膜等软组织缺失缺损不仅影响正常生理功能，还严重影响面容、心理和生活。随着人们对于生活品质的追求不断提高，颌面部的医美手术和治疗需求也快速增长。脐带等组织来源的MSC-EVs已被发现在皮肤创伤修复中具有较好效果，MSC-EVs可以激活Wnt通路并抑制转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）通路，在促进伤口愈合的同时有效抑制局部成纤维细胞增生所致的瘢痕形成[39]。脂肪MSC-EVs能够促进脂肪再生和维持脂肪移植物的存活，并应用于局部的软组织缺损和移植充填[40]。也有研究[41]提示脐带MSC-EVs具有一定的抗衰老作用，可通过传递增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）进入衰老的骨髓MSCs中，从而逆转干细胞的衰老。目前已有基于MSC-EVs的美容护肤产品上市，显示出广阔的应用前景[42]。

综上，MSC-EVs富含生物活性物质，可在细胞间进行高效的物质递送和信息交换。目前研究证实，多种MSCs来源的EVs不仅具有促进细胞增殖、迁移和多向分化的能力，还能够调控血管形成、神经再生和改善局部微环境，通过多种途径提高组织损伤修复和再生能力。目前MSC-EVs已被应用于牙髓、牙周组织、颌骨、颞下颌关节、颌面软组织等多种口腔颌面部组织的修复再生及疾病治疗中，展现出较大的应用潜力（图1）。

图1 MSC-EVs通过多种途径促进口腔颌面部组织再生Fig 1 MSC-EVs promote the regeneration of oral and maxillofacial tissue through multiple approaches

4 展望

虽然MSC-EVs在组织再生领域中的研究取得了快速进展，学界和产业界也清醒的认识到，MSC-EVs的大规模临床应用仍面临多个重大的问题，需要进一步的深入探索和科研攻坚。

在基础研究方面：MSC-EVs发挥组织再生功能的机制复杂，其中的关键活性成分尚待明确；目前的研究主要采用体外培养的MSCs所分泌的EVs，而MSCs在体内原位分泌的EVs的作用仍需更先进和精确的研究手段来探索；已有研究仍处于临床前研究阶段，尚无严格的循证医学证据比较其与现有临床治疗手段之间的优劣。在应用研究方向：临床级EVs的大规模生产、EVs的标准化生产、纯化、制备和保存、针对EVs异质性的精细制备和产品研发、EVs生产质量控制等诸多核心环节仍面临瓶颈问题[43]，需要进一步研发和优化MSC-EVs的提取和纯化技术，改进EVs的保存体系并进行严格的验证。同时相关监管机构和部门也需要组织专家进行深入研讨，及时出台相关的法规及管理要求。此外，在原生的MSC-EVs的基础上，如何通过改性、人为设计和修饰使其具有更强的效果及更高的安全性也是未来研究的重点[44]。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。