生长分化因子11对小鼠颞下颌关节骨关节炎髁突软骨细胞脂肪化的影响

王若欣刘倩何峰张勉王贺林

1.郑州大学口腔医学院，郑州450052；2.军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔疾病国际联合研究中心，第四军医大学口腔医院口腔解剖生理学教研室，西安710032；3.军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，第四军医大学口腔医院医疗康复科，西安710032

颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）骨关节炎（osteoarthritis，OA）是颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorder，TMD）的重症表现，14.56%的TMD患者具有TMJOA的影像学征象[1]。TMJ髁突软骨退变是TMJOA的主要病理改变，髁突软骨细胞作为TMJ髁突软骨中唯一的细胞类型，在软骨退变过程中发挥了决定性作用，但其具体机制仍有待进一步明确。近年来有研究[2]表明脂质代谢异常参与膝关节OA的病变发展，膝关节OA软骨细胞内可出现明显的脂肪化改变，但TMJ OA软骨细胞是否也有类似改变目前尚无报道。

生长分化因子11（growth differentiation factor 11，GDF11）又名骨形态发生蛋白11（bone mor‐phogenetic protein 11，BMP11），属于转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族，参与了骨骼的发育和牙本质形成[3-4]。近年来有研究发现GDF11可抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化[5-6]，也能够减轻低单核细胞及肝细胞的脂质沉积[7-8]。但目前TMJ OA退变软骨中GDF11的表达是否存在变化仍然缺少研究。

1 材料和方法

本研究通过第四军医大学口腔医院伦理委员会审查（2017伦审字007号）。

1.1 试剂

GDF11抗体（ab124721）、Adiponectin抗体（ab181281）（Abcam公司，英国）；山羊抗兔二抗试剂盒（SP-9001）、复合消化液、抗原修复液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；引物设计及合成由日本Takara公司完成；Trizol溶液（15596026，Thermo Fisher公司，美国）；RNA反转试剂盒PrimeScript RT Master Mix（RR036A）、实时定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）试剂盒SYBR Pre‐mix Ex TaqTMⅡ（RR820A）（Takara公司，日本）；DAB显色试剂盒（CW0125）（泰州康维世纪公司）。

1.2 动物模型建立及分组处理

6周龄雌性C57小鼠（150只）由第四军医大学动物中心提供，随机分为10组，分别为3周对照组、3周UAC实验组、7周对照组、7周UAC实验组、11周对照组、11周UAC实验组、7周UAC+PBS注射组、7周UAC+GDF11注射组、11周UAC+PBS注射组、11周UAC+GDF11注射组，每组实验动物数量15只。1%戊巴比妥麻醉小鼠后，在左侧上、下颌切牙粘接不良修复体。不良修复体利用15号注射针头制作，上颌不良修复体长度1.5 mm，下颌不良修复体导板长度1.5 mm，套筒管长度2.5 mm，导板与套筒管长轴成45°。隔湿后使用聚羧酸锌水门汀粘接不良修复体，整个过程在5 min内完成。整个实验期间保证不良修复体无脱落。对照组小鼠实施同样操作过程，但是不粘接不良修复体。

7周、11周UAC+PBS注射组/UAC+GDF11注射组小鼠于UAC造模后第二天开始行相关药物局部注射，1%戊巴比妥麻醉后沿颧弓后部向后上方进针，抵及骨面后将药物注入，注射量为20μL，隔天注射。

所有小鼠在同样条件下饲养。在各个实验时间点处死相应小鼠后，各组左侧15个髁突软骨随机分为3份，每份5个髁突软骨；右侧10个髁突随机分为2份，每份5个髁突软骨，这5份髁突软骨用于RNA的提取和后续实验。右侧剩余的5个髁突软骨用于组织染色。

1.3 总RNA提取、反转和real-time PCR

髁突软骨液氮冷冻5 min后充分砸碎，收集组织粉末后Trizol法提取总RNA。PrimeScript RT Master Mix试剂盒反转RNA，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行real-time PCR反应。Ⅱ型胶原（typeⅡcollagen，Col-Ⅱ）、聚蛋白多糖（Ag‐grecan）、Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen，Col-Ⅰ）、脂联素（Adiponectin）、脂肪酸结合蛋4（fatty ac‐id-binding protein 4，FABP4）、脂滴包被蛋白1（Perilipin 1）、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glycer‐aldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH），引物信息见表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

1.4 组织块处理及染色

分离的TMJ关节组织浸泡于4%多聚甲醛固定液中，固定24 h后10%乙二胺四乙酸（ethylenedi‐amine tetraacetic acid，EDTA）溶液（pH=7.4）脱钙4周，梯度乙醇脱水后石蜡包埋切片。石蜡切片常规脱蜡至水，参照免疫组化试剂盒说明书中描述的SABC法进行GDF11和Adiponectin免疫组化染色。番红O染色时，切片新鲜二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水；1%固绿溶液染色2 min，1%醋酸乙醇轻微洗涤10 s；1%番红O溶液染色5 min，95%乙醇轻微洗涤10～20 s；风干后新鲜二甲苯5 min透明，中性树胶封片。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对研究结果进行统计分析。所有数据采用平均值±标准差方式表示，同一时间点的两组数据比较采用独立样本t检验，P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 构建UAC致小鼠TMJOA模型

对6周龄小鼠施加UAC刺激后，TMJ髁突软骨呈现典型的OA样改变（图1）。与同期正常对照组相比，UAC实验组小鼠TMJ髁突软骨厚度在7周及11周后显著降低（7周：t=3.767，P=0.002 2；11周：t=4.604，P=0.000 2）（图1和图2A）。番红O染色显示UAC实验组小鼠TMJ髁突软骨基质成分大量丢失，番红O阳性面积在3、7及11周后显著减少（3周：t=2.942，P=0.018 6；7周：t=5.295，P<0.000 1；11周：t=7.06，P<0.000 1）（图1和图2B）。软骨基质标志分子Col-Ⅱ（3周：t=3.081，P=0.013 1；7周：t=3.852，P=0.001 7；11周：t=3.467，P=0.004 8）（图2C）和Aggrecan（3周：t=3.621，P=0.003 2；7周：t=3.258，P=0.008 3；11周：t=3.983，P=0.001 2）（图2D）的mRNA含量在UAC实验组小鼠TMJ髁突软骨中显著降低，而Col-Ⅰ的mRNA含量则显著升高（3周：t=13.42，P<0.000 1；7周：t=11.13，P<0.000 1；11周：t=10.12，P<0.000 1）（图2E）。

图1 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突软骨番红O染色结果 番红O染色 ×200Fig 1 Safranin Ostaining of TMJcondylar cartilagein normal and TMJOA mice safranin O staining ×200

图2 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突软骨退变情况对比Fig 2 Comparison of TMJcondylar cartilagein normal and TMJOA mice

2.2 正常对照组和UAC实验组小鼠髁突软骨中的脂肪化情况

在正常对照组小鼠TMJ髁突软骨中，Adipo‐nectin阳性细胞数量极少，而在3周UAC实验组TMJ髁突软骨中，浅层和中层出现大量Adiponec‐tin阳性软骨细胞（t=7.886，P<0.000 1）；在7周和11周时，UAC实验组TMJ髁突软骨中Adiponectin阳性软骨细胞继续增加，且在全层软骨广泛分布（7周：t=10.92，P<0.000 1；11周：t=12.64，P<0.000 1）（图3和图4A）。同时，Adiponectin（3周：t=7.025，P<0.000 1；7周：t=3.952，P=0.001 3；11周：t=4.83，P=0.000 1）（图4B）及另外两种脂肪化标志分子FABP4（3周：t=6.243，P<0.000 1；7周：t=13.42，P<0.000 1；11周：t=9.625，P<0.000 1）（图4C）、Perilipin 1（3周：t=5.243，P<0.000 1；7周：t=6.772，P<0.000 1；11周：t=11.14，P<0.000 1）（图4D）的mRNA含量在3、7及11周的UAC实验组TMJ髁突软骨中均显著增加。

图3 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突软骨Adiponectin免疫组织化学染色结果 免疫组织化学染色 ×200Fig 3 Adiponectin immunohistochemical staining of TMJcondylar cartilage in normal and TMJOA mice immunohistochemical staining ×200

图4 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突软骨内脂肪化情况对比Fig 4 Comparison of steatosis in TMJcondylar cartilage between normal and TMJOA mice

2.3 正常对照组和UAC实验组小鼠髁突软骨中GDF11的表达情况

在正常对照组小鼠TMJ髁突软骨中，GDF11阳性软骨细胞在全层软骨广泛分布，而在UAC实验组TMJ髁突软骨中，GDF11阳性细胞显著减少，且仅存在于软骨深层（3周：t=2.815，P=0.025 4；7周：t=6.815，P<0.000 1；11周：t=10.67，P<0.000 1）（图5和图6A）。同时，GDF11的mRNA含量在3、7及11周的UAC实验组TMJ髁突软骨中均显著降低（3周：t=2.869，P=0.022 3；7周：t=10.04，P<0.000 1；11周：t=17.57，P<0.000 1）（图6B）。

图5 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突软骨GDF11免疫组织化学染色结果 免疫组织化学染色 ×200Fig 5 GDF11 immunohistochemical staining of TMJcondylar cartilagein normal and TMJOA mice immunohistochemical staining ×200

图6 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突软骨内GDF11的表达对比Fig 6 Comparison of GDF11 expression in TMJcondylar cartilage between normal and TMJOA mice

2.4 GDF11局部注射对TMJOA髁突软骨的影响

对UAC实验组小鼠在TMJ周围局部分别注射GDF11和PBS。与PBS注射组相比，在GDF11持续注射7周和11周后，TMJ髁突软骨厚度（7周：t=3.136，P=0.010 4；11周：t=5.645，P<0.000 1）（图7A、B）和番红O阳性面积（7周：t=4.772，P=0.000 2；11周：t=4.989，P=0.000 1）（图7A、C）均显著增加；软骨基质标志分子Col-Ⅱ（7周：t=5.029，P=0.000 1；11周：t=4.67，P=0.000 3）（图8A）和Aggrecan（7周：t=5.276，P<0.000 1；11周：t=7.738，P<0.000 1）（图8B）的mRNA含量在GDF11注射组小鼠髁突软骨中显著增加，而Col-Ⅰ的mRNA含量则显著减少（7周：t=17.44，P<0.000 1；11周：t=14.39，P<0.000 1）（图8C）。与PBS注射组相比，在GDF11持续注射7周和11周后，TMJ髁突软骨中Adiponectin阳性细胞数量显著降低（7周：t=5.864，P<0.000 1；11周：t=8.487，P<0.000 1）（图7D、E）；同时Adiponectin（7周：t=4.973，P=0.000 1；11周：t=8.033，P<0.000 1）（图7F）、FABP4（7周：t=4.549，P=0.000 4；11周：t=5.003，P=0.000 1）（图8D）及Perilipin 1（7周：t=3.807，P=0.002 2；11周：t=6.662，P<0.000 1）（图8E）的mRNA含量也显著降低。

图7 PBS注射和GDF11注射小鼠髁突软骨退变、脂肪化情况对比Fig 7 Comparison of degeneration and steatosis in TMJcondylar cartilage between micewith PBSor GDF11 injection

图8 PBS注射和GDF11注射小鼠髁突软骨退变、脂肪化相关分子表达对比Fig 8 Comparisonof molecular expression related todegenerationand steatosisin TMJcondylar cartilagebetweenmicewith PBSor GDF11injection

3 讨论

TMJOA是TMD的重症表现，主要病理改变为TMJ髁突软骨的退变，但是目前TMJOA的致病因素尚未完全明确。在临床最常见的膝关节和髋关节OA发病过程中，异常生物力刺激起到了关键性的作用[10]。对于TMJ而言，在行使咀嚼功能时将承受生物力的刺激，而异常咬合将可能导致TMJ承受的生物力环境发生改变，进而诱发TMD甚至TMJOA[11]。在本研究中通过构建UAC改变小鼠的TMJ生物力学环境，成功在TMJ诱导出OA样的软骨退变，进一步证实了咬合异常因素在TMD和TMJOA发病中的关键作用。

OA的主要病理改变是软骨组织的退变，而软骨细胞作为软骨组织中唯一的细胞类型，在维持软骨稳态方面发挥了核心作用，软骨细胞功能活动的异常将不可避免地影响整个软骨的健康。近年来研究发现软骨细胞脂质代谢与OA发病有重要关联[12]，脂质代谢异常将导致软骨细胞内出现脂肪堆积等脂肪化表现，脂肪化程度则和OA严重程度呈现正相关关系[13-14]。在本研究中正常对照组小鼠TMJ髁突软骨内基本没有细胞脂肪化的表现，而TMJOA小鼠髁突软骨内Adiponectin、FABP4、Perilipin 1等脂肪化标志分子的表达显著升高，提示在TMJOA的髁突软骨中也存在软骨细胞脂肪化的表现。而且在3周时Adiponectin阳性细胞主要分布于TMJ髁突软骨的浅层和中层，在7周和11周时在软骨全层广泛表达，这一结果提示浅层和中层的TMJ髁突软骨细胞更容易在异常生物力刺激下发生脂质代谢的异常，出现软骨细胞的脂肪化。

GDF11已被证实可以抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化[5-6]，还可以抑制单核细胞[7]、肝细胞[8]内的脂质沉积，因此具有明确的抗脂肪化作用。本研究发现在正常对照组小鼠TMJ髁突软骨中，GDF11在软骨全层广泛高表达，而在TMJOA软骨中GDF11表达显著降低，且3周时主要在浅层和中层降低，7周和11周时全层降低。结合3周时软骨细胞脂肪化主要出现在髁突软骨的浅层和中层，7周和11周时出现在软骨全层的现象，提示GDF11的减少可能是TMJOA中软骨细胞脂肪化的重要原因。为进一步明确GDF11的抗脂肪化作用，本研究对TMJOA小鼠进行外源性GDF11的局部注射，注射组小鼠的TMJ软骨厚度和基质含量均有显著提升，且明显抑制了软骨细胞脂肪化，提示GDF11有望作为新型治疗药物用于OA的治疗，在抑制软骨细胞脂肪化进而延缓软骨退变方面发挥积极作用。与本研究结果相似，有文献[13]指出对老年小鼠给予GDF11后可以显著减轻膝关节软骨的增龄性退变，同样提示GDF11对于关节软骨的积极保护作用。

综上所述，异常咬合可以诱导TMJ髁突软骨出现OA病变，在TMJOA髁突退变软骨中存在广泛的软骨细胞脂肪化，补充外源性GDF11可以有效地抑制软骨细胞脂肪化进而缓解髁突软骨退变程度。GDF11有望成为新的OA治疗药物，但目前GDF11抑制软骨细胞脂肪化的具体机制仍然不明，需要后期进一步的研究和探索。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。